染色质免疫沉淀(ChIP)实验通过组蛋白修饰(表观遗传学)或转录因子-DNA 结合相互作用，监测转录调控，识别基因组和蛋白质组之间的联系。ChIP 实验的优势在于能够捕捉系统中特定蛋白质-DNA 相互作用，并使用定量聚合酶链反应(qPCR)对相互作用进行量化。染色质免疫沉淀实验需要多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解(蛋白质-DNA 提取)、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA 样本回收和 PCR。在优化实验中，通常使用凝胶电泳等附加技术来验证特定步骤。

CHIP 实验步骤

　　第 1 步：交联

　　染色质免疫沉淀(ChIP)实验始于稳定的共价的蛋白质-DNA 复合物。许多蛋白质与 DNA 的相互作用是短暂的，涉及多种蛋白质复合物来协调生物功能。体内交联共价稳定蛋白质-DNA 复合物。

　　体内交联传统上是用甲醛实现的，但可以与其他交联剂如 EGS 和 DSG 结合使用。甲醛交联是两种直接相互作用的分子的理想选择。然而，甲醛是一种零长度的交联剂，限制了其功能性。对于更高阶相互作用，较长的交联剂如 EGS(16.1?)或 DSG(7.7?)可以捕获具有复杂四元结构的较大蛋白质复合物。

　　研究人员经常使用交联剂的组合来捕获蛋白质-DNA 相互作用。这些交联剂直接渗透到完整的细胞中，有效地将蛋白质-DNA 复合物锁在一起，即使是短暂的相互作用复合物也能被捕获并稳定下来进行分析。

　　第 2 步：细胞裂解

　　裂解阶段从细胞或组织中提取交联蛋白-DNA 复合物，让它们进入溶液。在这个阶段，通过去污剂溶液溶解细胞膜，从而释放细胞组分。由于蛋白质和 DNA 的相互作用主要发生在核内，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。

　　去污剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA 复合物，因为在第一步中实现的共价交联将在整个 ChIP 过程中保持复合物的稳定性。

　　不建议对细胞进行机械裂解，因为这会导致效率不高的核裂解。

　　第 3 步：染色质制备(剪切/消化)

　　提取步骤产生所有核材料，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白-DNA 复合物。为了分析蛋白质结合序列，提取的基因组 DNA 必须被剪切成更小的可行片段。DNA 裂解通常是通过机械的超声波或微球菌核酸酶(MNase)消化来实现的。

　　理想的染色质片段范围在 200 到 1000bp 之间;然而，DNA 剪切是最难控制的步骤之一。超声波提供真正随机的片段，但局限性包括可能需要协调一致的专用设备、超声波过程中难以保持温度、延长的实际操作时间和更多的优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有高度的可重复性，更适合于处理多个样品，但由于酶活性的变化和酶对核小体间区域具有更高的亲和力，该消化过程可能导致变异。

　　第 4 步:免疫沉淀

　　为了分离特定的修饰组蛋白、转录因子或相关的辅助因子, ChIP 验证抗本被用于免疫沉淀并从其他核成分中分离出门目标。这一步骤有选择地富集了目标蛋白质-DNA 复合物,并消除了所有其他无关的细胞材料。

　　选择合适的抗体是 ChIP 实验成功的关键步骤。对于哺乳动物样本有许多 ChIP 级抗体可用于该步骤的验证。对于无法获得合格抗体的靶蛋白,可在生物样品中表达 HA、myc 或 GST 等融合蛋白,然后利用针对亲和标记的抗体对靶蛋白进行免疫沉淀。

　　抗体-蛋白质-DNA 复合物通过抗体结合树脂 (如固定化蛋白 A、蛋白 G 或蛋白 A/G) 亲和纯化。对于生物素化抗体,为了减少背景,有必要结合核酸和蛋白质阻断缓冲液 (如鲑鱼精子 DNA 和普通蛋白质源) 来阻断抗体结合珠。每个 ChIP 样品中使用的磁珠体积也会影响背景,因为磁珠体积的地增加会增加非特异性结合。

　　第 5 步:解交联与 DNA 净化

　　与目标蛋白质结合的 DNA 富集是染色质免疫沉淀的目标。DNA 水平可通过原脂糖凝胶电泳或更常用的定量聚合酶链凝胶电泳或更常用的定量聚合酶链凝胶电泳用的定量聚合酶链接反应 (qPCR) 测定。在染色质免疫沉淀实验的特定 DNA 产物被广增和测量之前,蛋白质和 DNA 之间必须解交联。

　　这通常是通过广泛的热孵育或通过蛋白酶 K 消化蛋白质组分来完成的。

　　蛋白酶 K 剪切在脂肪、芳香或疏水残基的羧基侧。由于其广泛的特异性,蛋白酶 k 常被用于从 DNA 或 RNA 样本制备中去除蛋白质。此外,蛋白酶 k 的消化消除了纯化 DNA 中的核酸酶,从而防止降解。为了从蛋白质片段中分离 DNA,酚氯仿与标准 DNA 纯化方法结合使用。或者,可以使用设计,用于从复杂生物样品中纯化核酸材料的纯化柱。

　　第 6 步: DNA 定量
　　qPCR 作为一种扩增技术,足够准确,可以在不同的实验条件下测量目标蛋白 DNA 水平。免疫沉淀复合物的数量与结束合 DNA 的数量有直接关系。

　　以上是与染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。