实时荧光定量-pcr试验

检测项目

核酸定量检测：

• Ct值测定：Ct值范围（0-40循环数），扩增效率（≥90%，参照MIQE指南）
• 拷贝数计算：绝对定量（动态范围10^2-10^9copies/μL），相对定量（内参基因校正率≥95%）

特异性验证：

• 熔解曲线分析：峰值温度偏差（≤0.5°C），引物二聚体检测（无峰形成）
• 交叉反应测试：非目标序列抑制率（≤5%，参照ISO20395:2018）

灵敏度分析：

• 检测限评估：最低检测浓度（LOD≤10copies/反应），定量限（LOQ≤50copies/反应）
• 稀释线性测试：回归系数（R²≥0.98）

精度测试：

• 批内重复性：Ct值变异系数（CV≤5%），批间再现性（CV≤10%）
• 回收率测定：目标回收率（85%-115%）

扩增性能：

• 引物效率：扩增斜率（-3.1至-3.6），荧光阈值设定（自动优化）
• 平台期分析：信号饱和度（最大荧光强度≥5000RFU）

干扰物质评估：

• 抑制剂测试：血色素抑制阈值（≤10mg/mL），溶剂残留影响（偏差≤2Ct）
• 基质效应验证：样本类型差异校正因子（±0.5Ct）

质量控制：

• 阴性对照：无扩增信号（Ct值=40），阳性对照：Ct值偏差（≤1.0）
• 内标监控：内参基因稳定性（CV≤3%）

仪器校准：

• 温度精度验证：热块均匀性（±0.1°C），循环时间偏差（≤1秒）
• 光学系统校准：荧光通道线性度（R²≥0.99）

样本处理：

• 核酸提取效率：回收率（≥80%），纯度（A260/A280比值1.8-2.0）
• 预扩增处理：反转录效率（≥95%，参照GB/T34797-2017）

数据分析：

• 基线校正：自动算法偏差（≤1%），阈值设定：手动/自动模式一致性
• 结果导出格式：标准化报告（Ct值、拷贝数、置信区间）

检测范围

1.临床样本：涵盖血清、血浆及咽拭子，重点检测病毒载量（如SARS-CoV-2RNA）和病原体定量，确保诊断准确性。

2.环境样本：包括水体、土壤及空气颗粒物，侧重监测微生物污染水平（如大肠杆菌DNA），强调低浓度检测。

3.食品样本：涉及肉类、谷物及转基因作物，检测转基因成分（如Bt基因）和食源性病原体，聚焦特异性验证。

4.细胞培养物：针对哺乳动物或细菌细胞，分析基因表达变化（如mRNA水平），重点评估扩增效率。

5.动物组织：包括脏器、血液及毛发，用于病原体筛查（如禽流感病毒），强调样本前处理优化。

6.植物材料：涵盖叶片、种子及根茎，检测病毒侵染（如TMVRNA）和转基因标记，侧重熔解曲线验证。

7.微生物样本：涉及细菌、真菌培养物，定量菌群丰度（如16SrRNA），确保高精度重复性。

8.法医样本：包括血迹、唾液及组织碎片，用于DNA指纹分析，重点检测限和干扰抑制。

9.工业产品：涉及生物制剂、疫苗及试剂，监控核酸残留（如宿主细胞DNA），侧重质量控制标准。

10.研究样本：涵盖基因编辑细胞或合成核酸，分析表达调控（如siRNA效率），强调数据标准化。

检测方法

国际标准：

• ISO20395:2018生物技术-核酸定量方法-实时荧光PCR性能要求
• MIQE指南（MinimumInformationforPublicationofQuantitativeReal-TimePCRExperiments）实验规范
• FDA指南-病毒载量检测分子方法

国家标准：

• GB/T34797-2017分子生物学检测方法通则
• GB/T37871-2019食品微生物实时荧光PCR检测方法
• YY/T1259-2015体外诊断试剂DNA定量检测试剂盒

方法差异说明：国际标准如ISO强调全局精度参数（如CV≤5%），而国家标准GB/T侧重特定应用场景（如食品样本前处理规范）；MIQE指南提供实验设计细节，国家标准则整合本土化验证要求。

检测设备

1.实时荧光定量PCR仪：QuantStudio5型（检测通道：6通道，温度精度±0.1°C）

2.荧光检测系统：CFX96Touch型（动态范围：10^1-10^10copies，分辨率0.01Ct）

3.热循环仪：AppliedBiosystems7500型（升降温速率：4.5°C/秒，控温均匀性±0.2°C）

4.核酸提取仪：QIAcubeHT型（通量：96样本/批次，提取效率≥95%）

5.分光光度计：NanoDropOne型（检测限：2ng/μL，波长范围190-850nm）

6.离心机：Eppendorf5424型（转速范围：100-15000rpm，容量24×1.5mL）

7.恒温混合器：ThermoMixerC型（温度范围：4-99°C，振荡频率300-1500rpm）

8.微量移液器：EppendorfResearchplus型（精度误差≤0.5%，体积范围0.1-1000μL）

9.生物安全柜：ESCOA2型（气流速度0.5m/s，HEPA过滤效率99.99%）

10.冷冻离心机：SorvallLegendXTR型（温度范围：-20°C至40°C，最大RCF30000xg）

11.恒温培养箱：MemmertINCO型（温度稳定性±0.1°C，容量150L）

12.电泳系统：Bio-RadPowerPac型（电压范围：10-300V，凝胶尺寸10×10cm）

13.纯水系统：MerckMilli-Q型（水质电阻率18.2MΩ·cm，TOC≤5ppb）

14.数据采集软件：QuantStudioDesign&Analysis型（实时监控功能，支持多格式导出）

15.样本存储冰箱：HaierDW-40L型（温度范围：-40°C至-86°C，容量400L）

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"实时荧光定量-pcr试验"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。