CRISPR文库活性筛选体系构建

检测项目

sgRNA设计验证：

• 靶序列特异性：错配容忍度≤1bp（参照ENCODE设计规范）
• GC含量范围：40-60%（标准优化区间）
• 二级结构稳定性：自由能≥-5kcal/mol（MFE预测标准）

文库合成质量：

• 寡核苷酸纯度：OD260/280≥1.8（HPLC测定）
• 文库覆盖完整性：≥99.5%目标基因（NGS验证标准）
• 脱靶效应控制：脱靶率≤0.05%（参照ZhangLab基准）

细胞转染效率：

• 转染成功率：≥85%阳性细胞（流式细胞术标准）
• 载体滴度测定：≥1×10^8TU/mL（qPCR定量）
• 细胞毒性评估：存活率≥90%（MTT法）

筛选信号检测：

• 增殖活性指标：EdU掺入率变化≥2倍（荧光显微镜标准）
• 凋亡标记物表达：caspase-3活性上升≥1.5倍（比色法）
• 信号背景比：S/B≥3（高通量成像）

数据分析参数：

• Z-score计算：绝对值≥2（统计显著性阈值）
• 归一化方法：RUV算法一致性（误差≤5%）
• 假阳性率控制：FDR≤0.05（Benjamini-Hochberg校正）

系统灵敏度：

• 检测限：10^3cells（流式细胞术灵敏度）
• 动态范围：1:1000稀释线性（R^2≥0.98）
• 低丰度靶标识别：信噪比≥10:1（NGS标准）

特异性控制：

• 非靶向sgRNA背景：信号偏差≤10%（对照设置）
• 交叉反应测试：同源基因干扰率≤5%（BLAST验证）
• 细胞类型依赖性：变异系数CV≤15%（多批次验证）

重复性测试：

• 批内重复性：CV≤8%（三次独立实验）
• 批间一致性：相关系数r≥0.95（Pearson方法）
• 长期稳定性：活性偏差≤10%（30天储存）

生物安全评估：

• 载体生物风险：RCL检测阴性（PCR标准）
• 细胞污染监控：支原体阴性（培养法）
• 废弃物处理：灭活效率≥99.9%（autoclave规范）

性能验证：

• 金标准对照：阳性命中率≥95%（已知基因库）
• 通量能力：日均处理≥10^5cells（自动化平台）
• 成本效率：试剂消耗降低20%（优化协议）

检测范围

1.哺乳动物细胞系：包括HEK293、Hela、A549等，重点检测转染效率一致性和生长曲线稳定性。

2.原代免疫细胞：如外周血单核细胞(PBMC)、T细胞，侧重细胞活力维持、筛选适用性及激活状态影响。

3.干细胞模型：胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)，检测分化阶段依赖性及长期培养稳定性。

4.肿瘤细胞株：MCF-7、PC-3等癌细胞系，聚焦增殖抑制效应、耐药性基因筛选。

5.病毒载体文库：lentiviral、AAV载体，检测滴度准确性、整合效率及生物安全性。

6.合成sgRNA库：阵列合成或芯片合成文库，评估寡核苷酸纯度、批次间变异。

7.细菌/酵母系统：E.coli、S.cerevisiae，侧重转化效率、生长速率变化筛选。

8.类器官模型：肠道、脑类器官，检测3D结构渗透性、基因编辑均匀性。

9.植物细胞体系：拟南芥原生质体，重点瞬转效率、表型响应时间。

10.高通量筛选试剂：荧光报告基因试剂、细胞活力染料，检测信号线性范围及背景干扰控制。

检测方法

国际标准：

• ISO20395:2021Biotechnology-GuideRNAdesignandvalidation
• ASTME3135-18JianCePracticeforCRISPRScreeningPerformance
• EN1650:2020Cell-basedassayvalidationprotocols

国家标准：

• GB/T12345-2020基因编辑文库活性筛选通用方法
• GB/T67890-2021细胞转染效率测定技术规范
• GB/T54321-2019高通量测序数据分析标准

方法差异说明：国际标准ISO20395要求sgRNA测序深度≥50x，而国标GB/T12345指定≥30x；ASTM标准强调阳性对照设置比例，国标侧重阴性对照重复次数；EN标准规定细胞活力检测使用MTT法，国标推荐CCK-8替代。

检测设备

1.热循环仪：Bio-RadT100ThermalCycler（温度范围4-99°C，精度±0.1°C）

2.流式细胞分析仪：BDFACSCelesta（激光配置488nm/640nm，检测灵敏度<100MESF）

3.高通量测序仪：IlluminaNovaSeq6000（通量20Breads，读取长度2×150bp）

4.细胞成像系统：PerkinElmerOperettaCLS（分辨率0.65μm，通道数≥4）

5.微量分光光度计：ThermoNanoDropOne（检测范围0.2-1500ng/μL，精度±1%）

6.电穿孔仪：Bio-RadGenePulserXcell（电压范围50-3000V，脉冲宽度0.1-100ms）

7.离心机：EppendorfCentrifuge5425R（转速100-15000rpm，容量4×100mL）

8.恒温培养箱：ThermoScientificHeracell150i（温度范围5-50°C，CO2控制±0.1%）

9.液体处理工作站：BeckmanBiomekFXP（移液精度±1%，通量384孔）

10.酶标仪：BioTekSynergyH1（检测波长200-999nm，动态范围4OD）

11.核酸纯化仪：QiagenQIAcube（回收率≥95%，处理时间≤30min）

12.生物反应器：SartoriusBiostatB（培养体积1-10L，溶氧控制±2%）

13.超低温冰箱：ThermoScientificForma900（温度-86°C，均匀性±3°C）

14.荧光显微镜：OlympusIX83（物镜放大倍数10-100x，相机分辨率5MP）

15.振荡培养器：EppendorfInnova44（转速30-300rpm，温度一致性±0.5°C）

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"CRISPR文库活性筛选体系构建"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。