检测项目

RNA提取质量控制：

  • RNA浓度：检测限2-15000ng/μl，纯度OD260/280比值1.8-2.0
  • RNA完整性：RIN值≥7.0（参照Agilent2100标准）
逆转录效率验证：
  • cDNA产量：定量范围5-500ng，效率偏差≤5%
  • 引物特异性：解链温度Tm值60-65°C
qPCR扩增检测：
  • Ct值：检测范围10-40循环，线性动态范围5logs
  • 扩增效率：90-110%，R²值≥0.98
特异性分析：
  • 熔解曲线分析：单峰检测，峰宽≤1°C
  • 非特异性扩增：阴性对照Ct值≥35
灵敏度评估：
  • 检测限LOD：1copy/μl，定量限LOQ：5copies/μl
  • 背景噪声：荧光信号强度≤100RFU
重复性测试：
  • 批内变异系数CV：≤5%，批间CV≤10%
  • 回收率：85-115%
标准曲线构建：
  • 斜率：-3.1至-3.6，截距范围-5至5
  • 线性范围：R²≥0.99
内参基因验证：
  • 表达稳定性：M值≤0.5，geNorm算法
  • 内参Ct值变异：SD≤0.5
差异表达计算：
  • foldchange：对数转换值|log2FC|≥1
  • p值：≤0.05，t检验或ANOVA
数据分析报告：
  • 相对表达量：ΔΔCt方法计算，单位foldchange
  • 质量控制参数：通过率≥95%

检测范围

1.人类血清样本：检测循环miRNA作为癌症生物标志物，重点评估样本稳定性和低丰度RNA提取

2.肿瘤组织样本：分析FFPE或新鲜组织中miRNA表达谱，侧重肿瘤特异性miRNA差异检测

3.细胞培养上清液：外泌体miRNA检测，强调外泌体分离纯化和表达一致性

4.脑脊液样本：神经疾病相关miRNA定量，重点处理低体积样本和高背景干扰

5.尿液样本：非侵入性miRNA检测，侧重尿液保存条件和抑制剂去除

6.全血样本：全血RNA中miRNA表达，重点红细胞裂解和RNA稳定性控制

7.福尔马林固定石蜡包埋组织：FFPE样本miRNA提取优化，检测重点为RNA碎片化补偿

8.植物组织样本：植物miRNA研究，侧重多酚和多糖干扰去除

9.动物模型样本：疾病模型miRNA表达分析，重点跨物种一致性验证

10.微生物样本：细菌或病毒miRNA检测，检测重点为高GC含量RNA处理

检测方法

国际标准：

  • MIQE2020实时荧光定量PCR实验最小信息指南（强调实验设计细节报告）
  • ISO20395-2019生物样本中核酸定量方法（侧重灵敏度验证）
国家标准：
  • GB/T30988-2014微小RNA检测技术规范（侧重临床样本处理）
  • GB/T37871-2019分子生物学检测通用要求（强调数据分析标准）
方法差异说明：MIQE指南要求完整实验参数报告，而GB/T30988-2014更注重样本前处理规范；ISO20395-2019设定检测限标准为1copy/μl，GB/T37871-2019允许5copies/μl定量限。

检测设备

1.分光光度计：Nanodrop2000（波长范围190-840nm，精度±0.001OD）

2.离心机：Eppendorf5424R（转速范围100-15000rpm，温度控制-10至40°C）

3.实时荧光定量PCR仪：Bio-RadCFX96（检测通道6个，温度精度±0.1°C）

4.热循环仪：AppliedBiosystemsVeriti（温度范围4-99°C，升温速率5°C/s）

5.电泳系统：Bio-RadPowerPacBasic（电压范围10-300V，电流0-400mA）

6.核酸提取仪：QIAcube（通量1-12样本，提取效率≥95%）

7.恒温培养箱：MemmertIN110（温度范围室温至60°C，稳定性±0.5°C）

8.超低温冰箱：ThermoScientificTSX（温度-86°C，容量700L）

9.移液器：EppendorfResearchplus（量程0.1-1000μl，精度±0.5%）

10.显微镜：OlympusBX53（放大倍数40-1000x，分辨率0.2μm）

11.外泌体分离系统：qEVoriginal（粒径分离范围50-200nm，回收率≥80%）

12.荧光显微镜：NikonEclipseTi（激发波长400-700nm，检测灵敏度0.1ng）

13.恒温混匀仪：EppendorfThermoMixer（转速300-1400rpm，温度4-99°C）

14.纯水系统：Milli-QIntegral（电阻率18.2MΩ·cm，TOC≤5ppb）

15.数据分析软件：CFXMaestro（算法支持ΔΔCt计算，兼容MIQE报告）