可送检的样品类型与对应检测项目
| 样品类型 | 典型应用场景 | 主要检测项目 | 常用方法 / 参考 |
|---|---|---|---|
| TRV-VIGS载体（pTRV1/pTRV2双元体系） | 本氏烟草、番茄、马铃薯、棉花等双子叶植物基因功能快速验证 | 插入片段序列一致性、读码框完整性、侵染性（侵染率与系统症状）、靶基因沉默效率 | SN/T 3440-2012《烟草脆裂病毒检疫鉴定方法》；Sanger双向测序；qRT-PCR相对定量（2^-ΔΔCt法，协议法） |
| BSMV-VIGS载体（α/β/γ三组分体系） | 小麦、大麦、水稻等单子叶作物基因沉默与抗病通路研究 | 体外转录物活性、摩擦接种侵染率、沉默表型出现率、沉默效率 | 体外转录与接种协议法；qRT-PCR；内参基因肌动蛋白、EF1α校正 |
| 农杆菌工程菌（GV3101、LBA4404、EHA105） | 侵染菌液制备、菌株保存复苏、载体共转化 | 菌株鉴定（菌落PCR）、质粒保真性、菌液浓度（OD600）、侵染液配比 | GB/T 19495.4-2018 定性PCR原理参照；菌落PCR与测序协议法 |
| 侵染后植株样品（叶、根、茎、花） | 沉默表型观察记录、靶基因表达量验证 | 靶基因mRNA下调率、PDS阳性对照白化表型、表型出现时间与持续期 | MIQE指南；qRT-PCR协议法；表型统计（每处理30株以上） |
| 组培苗、脱毒苗带毒筛查样品 | 组培传代监测、种苗健康度筛查、载体扩繁植株带毒监控 | TRV、番茄斑萎病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒等外源病毒携带情况 | GB/T 28982-2012；GB/T 28071-2011；SN/T 3440-2012（DAS-ELISA、RT-PCR） |
| 重组侵染质粒与载体库样品 | 载体库构建质控、质粒长期保藏前后比对 | 插入片段大小（200~500bp）、序列一致性100%、无碱基突变、酶切位点正确 | Sanger双向测序；酶切图谱验证；琼脂糖凝胶电泳 |
检测项目
1. 载体构建验证：插入片段与靶序列一致性100%，长度200~500bp，读码框完整无移码
2. 侵染性评价：侵染率85%以上，TRV接种后7~14d出现系统症状，扩繁叶片中载体病毒可检出
3. 沉默效率测定：靶基因mRNA下调率70%以上判定为有效沉默，高效体系可达85%~95%（qRT-PCR，2^-ΔΔCt法）
4. 阳性对照验证：PDS基因沉默白化表型于接种后7~14d出现，白化株率80%以上
5. 带毒筛查：载体病毒载量10^3~10^6拷贝每微升量级可定量检出，外源病毒核酸检出限100拷贝每反应以内
检测范围
1. 双子叶VIGS载体：TRV系pTRV1/pTRV2、TMV载体、CMV载体
2. 单子叶VIGS载体：BSMV大麦条纹花叶病毒α/β/γ三组分载体、BMV载体
3. 农杆菌感受态与工程菌：GV3101、LBA4404、EHA105、AGL1等菌株
4. 侵染后植物样品：本氏烟草、番茄、棉花、小麦、水稻等植株的叶、根、茎、果实
5. 重组质粒与载体库：含靶基因片段的重组侵染质粒、cDNA文库来源片段
检测方法
1. SN/T 3440-2012 烟草脆裂病毒检疫鉴定方法（DAS-ELISA、RT-PCR、免疫电镜与鉴别寄主法）
2. GB/T 19495.5-2018 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法
3. GB/T 19495.4-2018 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法
4. GB/T 28982-2012 番茄斑萎病毒PCR检测方法（RT-PCR与实时荧光RT-PCR）
5. GB/T 28071-2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法（TaqMan探针实时荧光RT-PCR）
6. GB/T 36829-2018 甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法（植株病原实时荧光定量参照）
7. 基因沉默效率qRT-PCR测定与农杆菌介导侵染流程暂无专属国家标准，按MIQE指南与文献协议执行
检测设备
1. 荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96）：6通道检出，温控精度±0.2℃，支持SYBR Green与TaqMan探针法
2. 通用PCR仪（Bio-Rad T100）：温控4~100℃，升温速率最高5℃/s，用于菌落PCR与RT-PCR扩增
3. 凝胶成像分析系统（Bio-Rad ChemiDoc）：核酸条带检出灵敏度达ng级，支持凝胶与化学发光成像
4. 超微量分光光度计（Thermo NanoDrop One）：核酸检出下限2ng/微升，A260/A280比值1.8~2.0判纯度
5. 高速冷冻离心机（Eppendorf 5430R）：最高转速17500r/min，温控-20~40℃，用于核酸与菌体分离
6. 恒温培养摇床：转速0~300r/min，温控4~60℃，农杆菌培养常用28℃、190r/min
7. 超低温保存箱：温控-40~-86℃，用于质粒、工程菌株与植物样品长期保存
8. 酶标仪（BioTek Synergy H1）：波长200~999nm连续可调，DAS-ELISA显色405nm读数
9. 电泳系统：琼脂糖凝胶电泳0~300V，配合核酸染料判读插入片段大小
10. 垂直流超净工作台：洁净度百级，用于无菌接种、菌液与植物样品操作