检测项目
1.扩增效率测定：计算效率值E，理想范围90%-110%，斜率标准-3.1至-3.6，相关系数R²≥0.99
2.特异性验证：检测非特异性扩增，熔解曲线分析，Tm值偏差±0.5°C，产物单一性确认
3.灵敏度测试：最低检测限评估，拷贝数下限10copies/μL，信噪比≥3:1
4.线性范围评估：标准曲线线性范围10⁰-10⁶copies/μL，R²值≥0.98，斜率误差±5%
5.重复性分析：intra-assay变异系数CV≤5%，三次重复测试一致性
6.再现性验证：inter-assay变异系数CV≤10%，不同批次间差异控制
7.引物二聚体检测：荧光信号基线分析，二聚体形成率≤5%，熔解峰高度评估
8.交叉污染控制：阴性对照无扩增，Ct值≥40或无信号，背景荧光阈值设定
9.抑制剂影响测试：内参基因扩增效率变化≤10%，抑制剂浓度阈值0.1ng/μL
10.扩增动力学分析：Ct值精度±0.5cycles，扩增曲线指数期斜率一致性
11.产物大小确认：凝胶电泳验证，条带大小偏差±5bp，亮度均匀性评估
12.定量准确性：相对定量误差≤15%，绝对定量标准品回收率85%-115%
检测范围
1.基因组DNA样品：human或animal来源，浓度范围1-100ng/μL，纯度A260/A280=1.8-2.0
2.质粒DNA模板：克隆载体DNA，浓度5-500ng/μL，超螺旋结构占比≥90%
3.病毒RNA样品：RNA病毒提取物，浓度0.1-50ng/μL，完整性RIN值≥7
4.细菌DNA样本：prokaryotic基因组DNA，GC含量20-80%，无多糖污染
5.真菌核酸样品：fungalDNA或RNA，浓度1-100ng/μL，细胞壁碎片去除
6.植物组织DNA：plant基因组DNA，多酚杂质≤0.1%，浓度2-200ng/μL
7.动物血液DNA：wholeblood提取DNA，血红蛋白抑制物≤0.05ng/μL
8.环境样本核酸：soil或water提取物，抑制剂浓度阈值0.5ng/μL，浓度0.5-50ng/μL
9.合成寡核苷酸：primers或probes，纯度HPLC≥95%，浓度10-1000nM
10.FFPE样本DNA：formalin-fixedtissue，片段化DNA大小100-1000bp，浓度1-50ng/μL
11.细胞培养物核酸：celllineDNA/RNA，活细胞数≥10⁵，浓度5-100ng/μL
12.临床拭子样本：swab提取核酸，人类DNA占比≤10%，病原体检测限
检测方法
国际标准：
ISO22174:2005分子体外诊断检验-核酸扩增方法
ASTME2888-19实时荧光定量PCR效率计算标准指南
ISO20395:2019分子生物学检测-灵敏度与特异性评估
ASTME2554-18扩增曲线分析标准实践
ISO17822:2020体外诊断检验-核酸提取与纯化
ASTME3024-15分子检测重复性与再现性验证
ISO15189:2022医学实验室-质量与能力要求
ASTME3134-18抑制剂检测标准方法
ISO20184-1:2018冷冻组织样本核酸检测
ASTME3219-20数字PCR定量准确性验证
国家标准：
GB/T37871-2019核酸扩增法检测试剂盒通用要求
GB/T34796-2017核酸定量测定-紫外分光光度法
GB/T37872-2019荧光定量PCR检测方法
GB/T34797-2017分子诊断试剂盒灵敏度与特异性
GB/T40982-2021新型冠状病毒核酸扩增检测指南
GB/T37873-2019核酸提取纯化试剂盒性能评价
GB/T39180-2020体外诊断检验-重复性测试方法
GB/T40983-2021生物样本库核酸质量检测
GB/T37874-2019微生物核酸检测通用规范
GB/T39181-2020临床样本PCR抑制剂评估
检测设备
1.实时荧光定量PCR仪：型号QPCR-2000.功能：多通道荧光检测，温度控制精度±0.1°C，扩增曲线实时分析
2.普通PCR仪：型号PCR-100.功能：热循环控制，温度范围4-99°C，升温速率3°C/s
3.紫外分光光度计：型号UVSpec-500.功能：核酸浓度测量，A260/A280比值计算，检测下限1ng/μL
4.荧光显微镜系统：型号FluoroImage-300.功能：凝胶成像，荧光信号捕获，条带强度量化
5.核酸提取仪：型号ExtractPro-600.功能：自动化提取，样本处理量1-96个，回收率≥90%
6.微量离心机：型号MicroCent-150.功能：高速离心，最大转速15000rpm，温度控制4-40°C
7.恒温水浴锅：型号WaterBath-50.功能：温度稳定性±0.5°C，范围室温-100°C，用于酶反应
8.超净工作台：型号CleanBench-200.功能：HEPA过滤，洁净度Class100，避免交叉污染
9.生物安全柜：型号BioSafe-400.功能：二级防护，气流控制，样本处理安全
10.电泳系统：型号GelElectro-700.功能：核酸片段分离，电压范围50-300V，成像分辨率1mm