三代测序文库构建标准化

检测项目

核酸质量检测：

• 片段大小分布：范围200-500bp（参照ISO20395）
• 浓度精度：偏差±5%（参照GB/T34044）
• 分子完整性：无降解迹象（参照ISO17025）

纯度检测：

• OD260/280比值：1.8-2.0（参照GB/T30989）
• 污染物水平：≤0.1%（参照ISO20395）
• 内毒素含量：<0.1EU/μL（参照ISO17025）

接头连接效率：

• 连接率：≥95%（参照GB/T34044）
• 接头完整性：全序列匹配（参照ISO20395）
• 条形码唯一性：100%unique（参照GB/T30989）

PCR扩增偏差：

• 扩增偏倚：≤2倍差异（参照ISO20395）
• GC含量偏差：±5%（参照GB/T34044）
• 扩增效率：CV≤10%（参照ISO17025）

文库稳定性：

• 存储稳定性：-20°C下≥6个月（参照GB/T30989）
• 冻融循环耐受：≤3次（参照ISO20395）
• 温度敏感性：偏差±1°C（参照GB/T34044）

生物安全检测：

• 无病原体：检测限10^3CFU/mL（参照ISO17025）
• 无核酸酶：活性≤0.01U/μL（参照GB/T30989）
• 样本追溯性：标识清晰（参照ISO20395）

测序兼容性：

• 测序深度一致性：CV≤10%（参照GB/T34044）
• 错误率：≤1%（参照ISO20395）
• 读长一致性：偏差±5%（参照GB/T30989）

样本处理效率：

• 反转录效率：≥90%（参照ISO17025）
• 片段化均匀度：CV≤5%（参照GB/T34044）
• 捕获特异性：≥95%（参照ISO20395）

质量控制参数：

• 通过率：≥98%（参照GB/T30989）
• 重复性：CV≤5%（参照ISO20395）
• 回收率：≥80%（参照GB/T34044）

环境适应性：

• 湿度敏感性：RH40-60%（参照ISO17025）
• 光照稳定性：无光降解（参照GB/T30989）
• 压力耐受：≤100kPa（参照ISO20395）

检测范围

1.基因组DNA文库：涵盖全基因组测序样本，重点检测片段大小完整性和浓度准确性，确保无降解。

2.RNA测序文库：包括mRNA和总RNA样本，重点检测反转录效率和rRNA去除率，提升转录本覆盖率。

3.宏基因组文库：涉及环境或微生物样本，重点检测多样性覆盖和抑制物去除，减少偏差。

4.FFPE样本文库：针对福尔马林固定石蜡包埋组织，重点检测片段化修复效率和DNA完整性。

5.单细胞文库：包括单细胞分离样本，重点检测细胞捕获率和扩增偏差，保证数据均一性。

6.长读长文库：适用于PacBio或Nanopore平台，重点检测大片段大小（>10kb）和低GC偏差。

7.靶向捕获文库：涉及外显子或特定区域，重点检测捕获效率和特异性，避免脱靶效应。

8.表观遗传文库：包括甲基化或修饰样本，重点检测修饰保留和扩增偏倚，确保表观标记准确。

9.微生物组文库：针对肠道或土壤样本，重点检测物种代表性和污染物控制。

10.临床样本文库：涵盖血液或组织样本，重点检测病原体检测限（≤10^3CFU/mL）和交叉污染控制。

检测方法

国际标准：

• ISO20395:2019生物技术-DNA测序-文库制备要求
• ISO17025:2017检测和校准实验室能力的一般要求
• ISO13485:2016医疗器械质量管理体系

国家标准：

• GB/T34044-2017高通量测序文库制备技术规范
• GB/T30989-2014生物样本库质量管理规范
• GB/T37864-2019生物样本核酸提取纯化技术规范

国际标准如ISO20395强调片段大小控制更严格（范围200-500bp），而国家标准GB/T34044侧重样本处理流程和偏差容忍度（如浓度偏差±5%vsISO±3%）。ISO17025要求全面质控体系，GB/T30989则聚焦样本追溯和稳定性。

检测设备

1.分光光度计：Nanodrop8000（波长范围220-750nm，精度±1%）

2.荧光计：Qubit4.0（检测限0.1pg/μL，动态范围0.1-1000ng/μL）

3.生物分析仪：Agilent2100（片段大小范围25-12000bp，分辨率1bp）

4.实时PCR仪：AppliedBiosystems7500（动态范围10^7，温控精度±0.1°C）

5.测序仪：PacBioSequelII（读长>10kb，精度Q30，通量8Mreads）

6.离心机：Eppendorf5424R（最大RCF21000xg，转速精度±10rpm）

7.恒温混匀器：ThermomixerC（温度范围4-99°C，混匀速度300-1500rpm）

8.电泳系统：Bio-RadCHEF-DRIII（脉冲场电泳，电压6V/cm，运行时间1-24h）

9.自动化工作站：HamiltonMicrolabSTAR（移液精度±0.5μL，通量96样本）

10.低温存储设备：ThermoScientific-80°C冰箱（温度稳定性±1°C，容量500L）

11.核酸提取仪：MagMAX96（通量96样本/运行，回收率≥90%）

12.片段仪：CovarisM220（聚焦超声，片段大小可调50-2000bp，功率峰值18W）

13.热循环仪：Veriti96-Well（温控精度±0.1°C，升温速率4°C/s）

14.凝胶成像系统：SyngeneG:BOX（分辨率1.4百万像素，检测限0.1ng）

15.质谱仪：ABSciex5600+（质量精度1ppm，检测范围50-40000m/z）

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"三代测序文库构建标准化"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。