siRNA沉默效率检测

检测项目

1.mRNA表达降低率检测：采用qRT-PCR定量分析，要求沉默效率≥70%，内参基因GAPDH/β-actinCt值偏差≤0.5

2.蛋白表达抑制率测定：通过WesternBlot或ELISA检测，目标蛋白表达量降低≥60%，灰度分析软件ImageJ验证

3.细胞转染效率验证：使用荧光标记siRNA（如FAM标记），流式细胞术检测转染效率≥80%

4.半衰期稳定性测试：37℃血清环境中孵育，要求24小时内降解率≤20%

5.脱靶效应评估：全转录组测序分析，非目标基因表达变化幅度≤15%

6.细胞毒性检测：CCK-8法测定细胞存活率≥90%，LD50值≥100μM

7.最小有效浓度确定：浓度梯度实验（1-100nM），ED50值≤20nM

8.沉默持续时间监测：单次转染后作用持续时间≥96小时

9.干扰特异性验证：ScrambledsiRNA对照组与实验组差异≥50倍

10.细胞内定位追踪：共聚焦显微镜观察胞质分布比例≥85%

11.RISC加载效率检测：AGO2蛋白免疫沉淀后NorthernBlot验证siRNA加载量

12.二级结构影响分析：熔点温度Tm值≥60℃，自由能ΔG≤-35kcal/mol

检测范围

1.化学合成siRNA：21-23nt双链结构，3'端dTdT悬垂，HPLC纯度≥95%

2.慢病毒载体表达shRNA：拷贝数≥10⁸TU/mL，空载体转染效率对照

3.脂质体包裹siRNA复合物：粒径100-200nm，Zeta电位+20~+30mV

4.纳米颗粒递送系统：PLGA材料包裹率≥80%，缓释时间≥72小时

5.稳定转染细胞系：嘌呤霉素筛选浓度1-10μg/mL，抗性维持≥15代

6.原代细胞转染样本：神经元/肝细胞原代培养≤P5代，电转参数300V/10ms

7.动物组织标本：裸鼠肿瘤模型瘤内注射，组织切片厚度5μm

8.体液样本中siRNA检测：血浆样本RNase抑制剂添加浓度1U/μL

9.冻干粉制剂：复溶后活性保留≥90%，水分含量≤3%

10.阳离子聚合物复合物：氮磷比（N/P）4:1-8:1，凝胶电泳阻滞完全

11.器官特异性递送系统：肝靶向配体GalNAc修饰率≥3分子/siRNA

12.温度敏感型水凝胶：相变温度34-37℃，包封率≥95%

检测方法

国际标准：

ISO20395:2019分子生物学检测-定量PCR方法验证要求

ASTME2935-18基因沉默效率评估标准指南

ISO20184-1:2018冷冻组织样本中RNA提取与质量控制

ASTMF2998-14细胞转染效率流式细胞术检测规范

ISO23118:2021蛋白质免疫印迹定量分析原则

国家标准：

GB/T34796-2017核酸定量测定-紫外分光光度法

GB/T37871-2019基因敲低效率检测指南

GB/T42076.1-2022细胞存活率检测-CCK-8法

GB/T42752-2023小干扰RNA产物纯度高效液相色谱分析法

GB/T43239-2023脱靶效应全转录组测序评估规范

检测设备

1.实时荧光定量PCR仪：型号QuantStudio7Pro，检测通道数6个，温度均一性±0.2℃

2.流式细胞仪：型号CytoFLEXS，检测灵敏度FITC≤100MESF，分析速度≥35,000细胞/秒

3.激光共聚焦显微镜：型号LSM900，Z轴分辨率0.35μm，荧光通道数5个

4.蛋白免疫印迹系统：型号iBlot2，转印时间7分钟，膜孔径0.2μm

5.高效液相色谱仪：型号1260InfinityII，色谱柱C18，检测波长260nm，保留时间偏差≤0.1min

6.纳米颗粒跟踪分析仪：型号NanoSightNS300，粒径检测范围10-2000nm，浓度检测下限10⁶particles/mL

7.超灵敏化学发光成像系统：型号AmershamImager680，像素分辨率4.3MP，动态范围4.8OD

8.细胞电转染系统：型号NeonNxT，电压范围100-2000V，脉冲宽度10-100ms

9.酶标仪：型号SpectraMaxiD5，检测波长范围200-1000nm，振荡速度1000rpm

10.生物分析系统：型号2100，RNA完整性指数（RIN）≥8.0，灵敏度0.5pg/μL

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"siRNA沉默效率检测"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检检测技术研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。