PCR特异性分析

检测项目

引物设计验证：

• 引物特异性：Tm值（55-65°C）、GC含量（40-60%）（参照ISO17025）
• 二聚体评估：自由能≤-5kcal/mol、序列同源性<70%

探针优化：

• 淬灭效率：荧光背景值≤100RFU（参照MIQE指南）
• 标记基团选择：FAM/Cy5兼容性（激发波长490nm/650nm）

扩增条件设置：

• 退火温度：梯度优化（范围50-65°C）
• 循环数：标准35-40cycles、延伸时间30s

模板质量检测：

• DNA浓度：检测限2-500ng/μL（A260/A280比1.8-2.0）
• RNA完整性：RIN值≥7.0（参照ISO22174）

非特异性扩增分析：

• 熔解曲线：Tm峰单一性（变异<1°C）
• 凝胶电泳：条带清晰度（无拖尾或杂带）

交叉反应测试：

• 同源序列干扰：非目标扩增率≤0.1%
• 多靶点验证：使用阴性对照样本

灵敏度评估：

• 检测限：LOD≤10copies/μL
• 定量线性：R²≥0.98（动态范围10^2-10^7copies）

特异性验证：

• 阴性对照：无扩增信号（Ct值>40）
• 阳性对照：信号强度阈值≥1000RFU

重复性测试：

• 批内变异：CV≤5%
• 批间变异：CV≤10%（参照GB/T19495.2）

定量准确性：

• 标准曲线斜率：-3.0to-3.5
• 回收率：95-105%

检测范围

1.人类基因组DNA：血液或唾液样本，重点检测SNP分型特异性和遗传突变位点

2.病毒RNA样本：SARS-CoV-2或流感病毒，侧重引物交叉反应和扩增效率验证

3.细菌DNA：大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，检测抗生素耐药基因特异性

4.植物DNA：转基因作物如玉米，关注外源基因插入位点分析

5.法医样本：微量DNA从毛发或皮肤，重点STR位点扩增特异性

6.环境样本：土壤或水体微生物DNA，检测群落多样性目标序列

7.食品样本：肉类或乳制品病原体，验证沙门氏菌等特异性检测

8.动物组织：小鼠或猪器官，侧重疾病标志物如肿瘤基因

9.细胞培养物：哺乳动物细胞系，检测基因表达靶标序列

10.合成寡核苷酸：人工设计引物或探针，验证序列纯度和结合特异性

检测方法

国际标准：

• ISO17025:2017测试和校准实验室能力要求（强调方法验证和不确定度评估）
• ISO22174:2005食物链微生物学PCR检测方法（规定引物设计和验证流程）
• MIQE指南2018实时定量PCR实验最低信息（覆盖引物特异性和数据报告）

国家标准：

• GB/T19495.2-2004转基因产品检测PCR方法（要求模板纯化和扩增条件优化）
• GB/T30989-2014核酸扩增检测技术规范（侧重阴性对照和重复性测试）
• GB/T37871-2019病原微生物核酸检测（规定灵敏度阈值和交叉反应标准）

（方法差异说明：国际标准如ISO17025注重整体实验室能力，而国家标准如GB/T19495.2更聚焦具体扩增参数；MIQE指南提供qPCR详细规范，GB/T30989则简化日常操作流程）

检测设备

1.PCR仪：AppliedBiosystemsVeriti（温度精度±0.1°C，热盖压力自动调节）

2.实时PCR仪：Bio-RadCFX96（检测通道6色，动态范围10^1-10^9copies）

3.凝胶电泳系统：Bio-RadPowerPacBasic（电压范围5-300V，胶板尺寸10x10cm）

4.紫外透射仪：VilberLourmatTFX-20.M（波长302nm，灵敏度0.1ngDNA）

5.核酸定量仪：NanoDropOne（检测范围2-15000ng/μL，波长260/280nm）

6.离心机：Eppendorf5425R（最大转速15000rpm，容量24x1.5mL）

7.移液器：GilsonPipetman（精度±0.5μL，量程0.1-1000μL）

8.恒温混匀器：ThermoMixerC（温度范围-10°Cto100°C，振荡速度300-1500rpm）

9.超纯水系统：Milli-QAdvantageA10（电阻率18.2MΩ·cm，流量1.5L/min）

10.生物安全柜：ESCOClassII（气流速度0.5m/s，HEPA过滤效率99.99%）

11.冰箱：ThermoScientificTSX（温度范围-40°Cto10°C，容积300L）

12.冷冻离心机：BeckmanCoulterAllegraX-15R（温度-10°C，最大RCF15000xg）

13.测序仪：IlluminaMiSeq（读长2x300bp，通量25Mreads）

14.微阵列扫描仪：AgilentSureScan（分辨率2μm，动态范围10^4）

15.分光光度计：ShimadzuUV-1800（波长范围190-1100nm，带宽1nm）

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"PCR特异性分析"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。