检测项目

特异性检测：

• 甲基化阳性率：≥95%（参照ISO17025）
• 非甲基化抑制率：≤5%
• 交叉反应性：无非特异性扩增

• 检测下限：0.1%甲基化DNA
• 定量范围：0.1%-100%甲基化水平
• 稀释系列线性：R²≥0.98

• 批内变异系数：CV≤5%
• 批间变异系数：CV≤10%
• 扩增效率：90%-110%

• 甲基化水平偏差：±2%
• 阳性符合率：≥98%
• 阴性符合率：≥95%

• 最低DNA输入量：1ng
• 扩增产物浓度：≥10ng/μL
• 背景噪声控制：≤2%假阳性

• 降解样本恢复率：≥85%
• 抑制剂耐受：血红素≤1mg/mL
• pH适应范围：7.0-8.5

• 引物保存期：-20°C下≥12个月
• 酶活性保持：≥95%活性
• 缓冲液有效期：室温下≥6个月

• 退火温度精度：±0.5°C
• 变性温度稳定性：94°C±1°C
• 延伸时间误差：±5秒

• 扩增曲线阈值：Ct值≤35
• 熔解曲线峰宽：≤1°C
• 数据归一化：内参基因ΔΔCt法

• 阳性对照验证：100%检出率
• 阴性对照验证：0%假阳性
• 空白对照：无污染信号

检测范围

1.细胞培养DNA：涵盖HeLa、HEK293等细胞系，检测重点为培养过程甲基化漂移验证

2.组织切片DNA：包括福尔马林固定石蜡包埋样本，侧重DNA提取纯度与扩增抑制物清除

3.血液样本DNA：全血或血清来源，重点检测白细胞甲基化水平与溶血干扰排除

4.唾液样本DNA：口腔脱落细胞，关注细菌污染控制与低浓度DNA扩增

5.尿液样本DNA：泌尿系统细胞，检测重点为尿素抑制效应与甲基化位点稳定性

6.FFPE组织DNA：病理存档样本，侧重交联DNA修复与扩增效率优化

7.植物DNA：如拟南芥叶片，重点检测多糖杂质去除与甲基化模式验证

8.细菌DNA：研究用菌株，关注基因组甲基化同源性分析

9.法医样本DNA：微量或降解样本，检测重点为STR位点甲基化关联性

10.古DNA样本：考古来源，侧重脱氨基损伤校正与污染监控

检测方法

国际标准：

• ISO20395-2019分子诊断检测验证要求
• ISO17025-2017检测实验室能力要求
• CLSIMM19-A核酸扩增方法验证指南

• GB/T27417-2017合格评定分子检测方法验证
• GB/T34796-2017核酸扩增检测方法通则
• YY/T1596-2017甲基化检测试剂盒技术要求

检测设备

1.热循环PCR仪：AppliedBiosystems9700型（温度范围4°C-99°C，精度±0.1°C）

2.实时荧光定量PCR仪：Bio-RadCFX96型（检测通道6个，灵敏度0.1拷贝）

3.电泳设备：ThermoFisherE-Gel系统（电压范围50-150V，分辨率≤10bp）

4.分光光度计：NanoDropOneC型（波长260/280nm，检测限0.2ng/μL）

5.离心机：Eppendorf5424R型（转速14,000rpm，温控4°C-40°C）

6.恒温器：GrantInstrumentsJB系列（温度稳定性±0.2°C，范围20°C-100°C）

7.凝胶成像系统：SyngeneGBox（CCD分辨率5MP，曝光时间1-60秒）

8.DNA提取仪：QIAGENQiacube（通量12样本，提取效率≥90%）

9.微量移液器：GilsonPipetmanL型（体积范围0.1-1000μL，精度±1%）

10.恒温水浴：MemmertWNB14（温度精度±0.1°C，容量14L）

11.生物分析仪：Agilent2100型（片段分析范围25-12,000bp，CV≤5%）

12.测序仪：IlluminaMiSeq（读长2x300bp，通量25Mreads）

13.温控设备：VWRScientific1260型（梯度温控±0.3°C，程序存储10个）

14.数据记录仪：OmegaEngineeringRDXL系列（采样率1Hz，存储容量2GB）

15.振荡器：IKAKS260型（转速50-1500rpm，振幅3mm）