心肌细胞线粒体活性监测实验

检测项目

呼吸功能监测：

• 耗氧率测定：基础OCR（pmol/min）、最大呼吸容量（参照ISO21337）
• 呼吸控制比：RCR≥4.0（表示偶联效率）
• 质子泄漏速率：寡霉素抑制后OCR变化（%）

能量代谢分析：

• ATP生成量：实时ATP合成速率（nmol/min/mg蛋白）
• ADP/ATP比值：荧光法测定（比值≤1.2）
• 糖酵解通量：ECAR值（mpH/min）

膜电位动态：

• Δψm监测：JC-1荧光红绿比（590/530nm）
• 膜电位稳定性：去极化响应时间（秒）
• MPTP开放度：钙诱导开放概率（%，参照GB/T38496）

氧化应激指标：

• 活性氧生成：DCF荧光强度（RFU，激发/发射485/535nm）
• 超氧化物水平：MitoSOX荧光（相对单位）
• 抗氧化酶活性：SOD活性（U/mg蛋白）

钙离子调控：

• 胞浆钙振荡：频率（次/分钟）、幅度（nM）
• 线粒体钙摄取：Rhod-2荧光变化率（%/秒）
• 钙释放通道活性：RyR开放率（%）

酶活性检测：

• 复合物I活性：NADH氧化速率（U/mg蛋白）
• 复合物III活性：细胞色素c还原率
• 柠檬酸合酶活性：比色法测定（μmol/min/mg）

形态学评估：

• 线粒体形态：嵴结构完整性评分（1-5级）
• 融合/分裂指数：DRP1/MFN1蛋白比值
• 体积密度：电镜三维重构（μm³/细胞）

DNA完整性：

• mtDNA损伤：8-OHdG含量（ng/μgDNA）
• 拷贝数变异：qPCR相对定量（倍数变化）
• 突变率检测：测序错误频率（/10kb）

通透性评估：

• 膜通透性：钙黄绿素滞留率（%）
• 肿胀指数：吸光度变化（520nmΔA/min）
• 细胞色素c释放：Westernblot半定量

功能协同性：

• 氧化磷酸化效率：P/O比值（molATP/molO）
• 底物利用率：谷氨酸/丙酮酸消耗比
• 应激响应：缺氧复氧后功能恢复率（%）

检测范围

1.原代心肌细胞：源自啮齿类或人类心脏组织，重点检测线粒体呼吸链动态响应及病理模型下的OCR衰减。

2.心肌细胞系：H9c2或AC16细胞株，侧重高吞吐量筛查中的ATP生成效率和ROS累积阈值。

3.心肌组织切片：新鲜或冷冻切片（厚度5-10μm），检测重点为区域特异性线粒体膜电位异质性。

4.心脏器官模型：Langendorff灌注心脏，评估整体器官水平线粒体耗氧动力学及钙调控缺陷。

5.干细胞分化心肌细胞：iPSC来源心肌细胞，聚焦发育阶段线粒体成熟度（如RCR进展）及药物毒性响应。

6.3D心肌细胞培养：类器官或球状体模型，检测重点为微环境下线粒体形态适应性和代谢梯度。

7.急性分离心肌细胞：酶解法制备单细胞，侧重实时膜电位振荡及离子通道耦合效率。

8.固定化心肌样本：甲醛或冷冻固定制剂，用于长期形态学分析如嵴结构评分和融合指数。

9.线粒体粗提物：差速离心分离线粒体，重点检测离体状态下复合物酶活性和MPTP敏感性。

10.病理模型细胞：缺血再灌注或肥大诱导样本，检测氧化损伤累积及功能恢复能力阈值。

检测方法

国际标准：

• ISO21337:2018细胞线粒体呼吸功能测定方法
• ISO10993-5:2021医疗器械生物学评价-细胞代谢活性试验
• ASTME2520-15荧光探针法评估膜电位标准指南
• OECDTG455体外细胞毒性高通量筛查协议

国家标准：

• GB/T38496-2020细胞能量代谢检测技术规范
• GB/T16886.5-2017医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验
• GB/T35823-2018线粒体功能荧光分析法通则
• GB/T33210-2016细胞氧化应激参数测定方法

方法差异说明：ISO21337采用海马仪标准化OCR测定，而GB/T38496整合多板读板器协议，导致数据采集频率差异（ISO每2分钟vsGB每5分钟）；ASTME2520规定JC-1染色浓度上限，GB/T35823允许动态调整以适配高背景样本；OECDTG455侧重毒性筛查通量，GB/T16886.5更注重医疗器械兼容性验证。

检测设备

1.细胞呼吸测定仪：SeahorseXFe96（OCR检测范围0-2000pmol/min，精度±2%）

2.荧光显微镜：OlympusFV3000（分辨率0.2μm，激发波长405-640nm）

3.流式细胞仪：BDFACSAriaIII（检测通道18个，流速12μL/min）

4.微孔板读板器：PerkinElmerEnVision（动态范围0-4OD，温控±0.1°C）

5.激光共聚焦显微镜：ZeissLSM980（Z轴分辨率0.5μm，共焦针孔尺寸10μm）

6.原子力显微镜：BrukerDimensionIcon（力分辨率0.1pN，扫描范围90μm）

7.电化学检测系统：CHI760E（电流范围±250mA，采样率1MHz）

8.实时PCR仪：RocheLightCycler480（温控精度±0.1°C，通道数6）

9.超速离心机：BeckmanOptimaXPN-100（最大转速100,000rpm，温控4-40°C）

10.恒温振荡培养箱：ThermoForma3110（温度范围5-50°C，CO2控制±0.1%）

11.光度计：ShimadzuUV-2600i（波长范围190-1400nm，带宽1nm）

12.电泳系统：Bio-RadMini-PROTEAN（电压范围10-500V，凝胶尺寸8x10cm）

13.冷冻切片机：LeicaCM1950（切片厚度1-100μm，样品温度-30°C）

14.质谱仪：ThermoQExactiveHF（分辨率240,000，质量精度<3ppm）

15.显微操作仪：EppendorfTransferMan（移动精度0.1μm，最大负载50g）

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"心肌细胞线粒体活性监测实验"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。