检测项目

1.质粒浓度测定：紫外分光光度法测定A260/A280比值（1.8-2.0），荧光定量法检测灵敏度≥0.2ng/μL

2.超螺旋结构比例：琼脂糖凝胶电泳分析（0.8%凝胶），毛细管电泳法分辨率≤10bp

3.宿主DNA残留量：qPCR定量检测限≤0.1ng/mg质粒DNA

4.内毒素水平：鲎试剂法测定EU/mg值（标准≤10EU/μg）

5.抗生素抗性验证：LB平板培养法（卡那霉素50μg/mL，氨苄青霉素100μg/mL）

检测范围

1.克隆载体质粒：pUC系列、pET系列等大肠杆菌表达载体

2.病毒包装质粒：腺相关病毒（AAV）辅助质粒系统

3.CRISPR基因编辑质粒：sgRNA表达载体及Cas9载体

4.重组蛋白表达质粒：哺乳动物细胞表达载体（如pcDNA3.1）

5.疫苗开发用质粒：DNA疫苗载体（含强启动子元件）

检测方法

ISO21571:2005食品微生物学-核酸提取方法（质粒纯化）

ASTME3027-15超螺旋DNA定量分析标准指南

GB/T34796-2017质粒DNA提取试剂盒检测通则

GB4789.41-2020食品微生物检验肠杆菌科检验（宿主菌检测）

ISO11737-1:2018灭菌过程生物负载测定（内毒素检测）

检测设备

1.NanoDropOne超微量分光光度计：波长范围190-850nm，样品量1-2μL

2.Agilent4200TapeStation系统：DNA完整性分析（DIN值≥7.0）

3.ThermoFisherQubit4.0荧光计：高灵敏度核酸定量（dsDNAHS检测试剂盒）

4.Bio-RadCFX96实时定量PCR仪：宿主残留DNA定量（SYBRGreen法）

5.Eppendorf5430高速离心机：最大转速30,000rpm（质粒沉淀分离）

6.GEHealthcareKTApure层析系统：亲和层析法纯化质粒DNA

7.LonzaResolute电泳仪：脉冲场电泳分析大分子量质粒

注意事项

1.BSL-2级实验室操作含抗生素抗性基因的质粒材料

2.DNase/RNase-free环境进行电泳及PCR相关实验

3.长期储存应使用TE缓冲液（pH8.0）于-80℃冻存

4.酶切验证需设置未酶切对照及分子量标准品对照

5.内毒素检测前需进行样品预处理（离子交换去除干扰物）