可送检的样品类型与对应检测项目
| 样品类型 | 典型应用场景 | 主要检测项目 | 常用方法 / 参考 |
|---|---|---|---|
| 疑似病料（脾脏、肾脏、淋巴结、关节液、心内膜赘生物） | 急性败血症型与亚急性疹块型猪丹毒的病原学确诊 | 病原分离培养、革兰染色镜检、菌落特征观察、生化鉴定、特异性PCR扩增 | NY/T 566-2019《猪丹毒诊断技术》；血平板37℃培养24～48 h，观察光滑型微小菌落与狭窄溶血环 |
| 纯培养菌株（田间分离株、冻干保存株、参考株） | 流行病学档案建立、菌株定性与保藏核实 | 血清型鉴定（1a、1b、2～24及N型）、MLST管家基因测序分型、MLVA重复序列分型、毒力基因筛查 | SN/T 4920-2017《猪丹毒检疫技术规范》；SN/T 4525.3-2016 MLST方法学参考 |
| 基因组DNA提取液 | 分子分型、克隆群划分与传播链追溯 | 核酸浓度与纯度、全基因组测序、SNP位点比较、基因型注释与聚类分析 | GB/T 37874-2019《核酸提取纯化方法评价通则》；GB/T 40226-2021高通量测序流程参考 |
| 猪群监测样品（扁桃体拭子、鼻咽拭子、全血、粪便） | 种猪场带菌筛查、疫病净化考核与引种隔离监测 | 特异性核酸定性检测、菌落计数、带菌率统计 | 参照NY/T 566-2019病原学与分子诊断流程执行 |
| 疫苗株与野毒株比对样品 | 疫苗株与流行株匹配度评估、免疫程序复核 | spaA等保护性抗原基因比较、表面蛋白型别判定、全基因组比较图谱 | 全基因组测序结合NY/T 4686-2025细菌菌种鉴定分子生物学方法 |
| 环境与物料样本（圈舍涂抹样、饮水、饲料） | 污染来源排查与生物安全水平评估 | PCR定性筛查、分离鉴定、环境带菌水平测定 | SN/T 4920-2017检疫技术规范及NY/T 566-2019诊断流程 |
检测项目
1. 血清型鉴定：覆盖1a、1b、2～24型及N型共26个型别，采用血清凝集试验判定分离株型别归属
2. 特异性PCR扩增：针对猪丹毒丝菌16S rRNA区等特异片段定性扩增，循环数35～40，设置内标、阴性对照与阳性对照
3. MLST序列分型：测定7个管家基因座位片段，序列比对获得等位基因谱与序列型（ST型），支撑跨实验室结果互通
4. 毒力与耐药基因筛查：spaA等保护性抗原基因、表面蛋白型别及erm、tet等耐药基因定性筛查，评估菌株致病与耐药潜力
5. 全基因组比较分析：测序覆盖深度不低于50×，以SNP差异阈值划分传播簇并构建聚类树，支撑溯源判定
检测范围
1. 临床病料：急性败血症型脾脏与肾脏样品、亚急性疹块型皮肤疹块样品、慢性型关节液与心内膜赘生物
2. 分离菌株：血清型1a型、1b型、2型等代表性型别分离株，标准菌株、田间强毒株与疫苗弱毒株
3. 猪群监测样品：种猪扁桃体拭子、育肥猪鼻咽拭子、断奶仔猪粪便等带菌筛查样品
4. 环境与物料：产房与育肥舍环境涂抹样、饮水水样、饲料及原料等生物安全排查样品
5. 疫苗比对样品：活疫苗株、灭活疫苗株与流行野毒株的匹配度评估样品
检测方法
1. NY/T 566-2019 猪丹毒诊断技术（病原分离鉴定与分子诊断主依据）
2. SN/T 4920-2017 猪丹毒检疫技术规范（进出境检疫与定性筛查流程）
3. NY/T 4686-2025 直接饲喂微生物和发酵制品类饲料添加剂生产菌株 细菌菌种鉴定 分子生物学方法（细菌分子鉴定通用流程）
4. GB/T 34746-2017 犬细小病毒基因分型方法（动物病原基因分型流程参考）
5. GB/T 37874-2019 核酸提取纯化方法评价通则（核酸质量与提取效率评价）
6. SN/T 4525.3-2016 出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第3部分：副溶血性弧菌（MLST分型方法学参考）
检测设备
1. 荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96)：96孔通量，升降温速率最高5℃/s，温控精度±0.2℃，支持FAM、VIC、ROX、Cy5多通道检测
2. 普通PCR扩增仪(Bio-Rad T100)：96孔样品基座，温度范围4～100℃，控温精度±0.2℃，支持梯度退火
3. 二代基因测序仪(Illumina MiSeq)：双端读长2×300 bp，单次运行最大输出15 Gb，满足MLST与全基因组测序需求
4. 纳米孔测序仪(Oxford Nanopore MinION)：单条读长可达上百kb，实时碱基识别，适合快速溯源与基因组完整性补齐
5. 超微量分光光度计(Thermo NanoDrop One)：检测波长190～850 nm，样品需求量1～2 μL，评估核酸浓度与A260/A280纯度比值
6. 二氧化碳培养箱(Thermo 371)：温度范围室温+5～50℃，CO2浓度控制0～20%，控温精度±0.1℃
7. 生物安全柜(博科BSC-1100IIA2-X)：工作区洁净度ISO 5级，垂直下降风速0.25～0.45 m/s，保障病原操作生物安全
8. 生物显微镜(Olympus BX43)：配置4×～100×油镜物镜与相差模块，配套显微成像系统用于菌形与菌落观察
9. 高速冷冻离心机(Eppendorf 5425R)：最大转速15000 rpm，最大相对离心力21130×g，温控范围-10～40℃
10. 超低温冰箱(Haier DW-86L588)：控温范围-40～-86℃，容积588 L，用于菌株、核酸与质控样品保存