检测项目

1.病原菌分离培养：采用PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂），培养温度251℃，暗培养7天观察菌落形态

2.分子生物学鉴定：针对EF-1α基因（扩增片段586bp）和β-tubulin基因（扩增片段350bp）进行PCR特异性检测

3.孢子悬浮液浓度测定：血球计数板法测定分生孢子浓度≥110^6CFU/mL

4.维管束褐变指数：茎基部横切面褐变面积占比分级（0级无褐变至4级＞75%）

5.寄主抗性测试：幼苗接种后21天病情指数（DI）计算（DI=Σ(病级株数)/(最高级总株数)100）

检测范围

1.金盏花栽培基质及田间土壤样本（0-30cm耕作层）

2.金盏花种子及种苗（包括胚轴与子叶组织样本）

3.发病植株根茎部维管束组织（直径＞2mm木质化茎段）

4.灌溉水样（过滤膜法收集≥0.45μm颗粒物）

5.农用器械表面拭子样本（无菌棉签采集面积10cm）

检测方法

1.ISO16140-3:2021《分子生物学方法验证规范》用于PCR引物特异性验证

2.GB/T28068-2011《农作物病害分级与调查》指导病情指数计算

3.ASTMD7907-14《植物病原真菌分离培养标准指南》规范培养基制备流程

4.NY/T3088-2017《植物检疫样品分子检测通则》规定DNA提取与扩增条件

5.GB/T3543.4-1995《农作物种子检验规程》适用于种苗带菌率测定

检测设备

1.ThermoFisherQuantStudio5实时荧光定量PCR仪（96孔板设计，支持TaqMan探针法）

2.OlympusBX53生物显微镜（配备DP27数码相机，1000油镜观察分生孢子梗）

3.MemmertIPP110培养箱（温度波动0.3℃，程序化湿度控制）

4.SartoriusCP225D电子天平（量程220g，精度0.01mg）

5.Eppendorf5430高速离心机（最大转速15,000rpm，温控范围-20℃至40℃）

6.MilliporeMilli-QIQ7000超纯水系统（电阻率18.2MΩcm）

7.Bio-RadChemiDocMP成像系统（化学发光与荧光双模式检测）

8.EscoAC2-4S1生物安全柜（H14级HEPA过滤器）

9.LabconcoFreeZone2.5L冷冻干燥机（冷阱温度-84℃）

10.HettichRotina420离心机（角转子适配15mL离心管）