活性氧簇生成速率荧光标记测定

检测项目

荧光探针性能检测：

• 探针灵敏度：最低检测浓度（LOD，≤1nM，参照ISO21331）、荧光量子产率（Φ，≥0.8）
• 探针选择性：对·OH、O2^-·、H2O2的交叉反应率（≤5%）、细胞毒性（CC50≥100μM）
• 探针稳定性：荧光衰减率（≤2%/h，37℃孵育条件）、pH适应性（5.0-8.0范围内荧光强度波动≤10%）

ROS生成动力学检测：

• 初始生成速率（v0，pmol·min^-1·mg^-1蛋白）、最大生成速率（vmax，pmol·min^-1·mg^-1蛋白）
• 达峰时间（tpeak，min）、荧光强度-时间曲线下面积（AUC，RFU·min）
• 底物依赖性：米氏常数（Km，μM）、最大反应速率（Vmax，pmol·min^-1）

细胞内ROS定位检测：

• 线粒体ROS：共定位系数（Pearson，≥0.7，参照CellBiologyTechniques）、荧光强度比（线粒体/细胞质，≥2.5）
• 细胞质ROS：区域荧光均匀度（变异系数≤15%）、时间依赖性分布（1-60min动态变化）
• 细胞核ROS：荧光信号面积（占核面积比例，≥10%）、核质荧光比值（≥1.2）

抗氧化剂效能评价：

• 清除速率常数（kscavenging，M^-1·s^-1，参照GB/T40185）、半数抑制浓度（IC50，≤50μM）
• 抗氧化容量（TEAC，Trolox等价物，≥1.0mmol/L）、协同效应系数（CTC，≥1.5）
• 长期保护作用：24小时后ROS残留率（≤20%）、细胞存活率（≥80%）

环境样品ROS检测：

• 水体ROS生成潜能：单位体积ROS产量（pmol·L^-1·h^-1，参照EN16479）
• 土壤提取物ROS：单位质量释放速率（pmol·g^-1·min^-1）、稳定性（24小时内衰减率≤30%）
• 大气颗粒物ROS：细胞暴露后ROS升高倍数（≥1.5倍，参照ASTME2945）

药物诱导ROS检测：

• 浓度依赖性：ROS生成倍数（相对于对照组，≥2倍为阳性）、EC50（有效浓度，≤10μM）
• 时间依赖性：峰值时间（tmax，min）、持续时间（≥30min）
• 细胞类型特异性：肿瘤细胞/正常细胞ROS比值（≥3:1）

植物组织ROS检测：

• 叶片H2O2：单位鲜重含量（μmol·g^-1FW，参照PlantPhysiologyProtocol）、气孔周围分布（荧光强度梯度≥0.5RFU/μm）
• 根毛O2^-·：生成速率（nmol·cm^-2·h^-1）、根尖/根毛比值（≥2:1）
• 果实ROS：成熟过程中积累速率（μmol·d^-1·fruit^-1）、抗氧化酶关联度（SOD活性与ROS负相关系数≥-0.7）

微生物ROS代谢检测：

• 细菌胞内ROS：荧光强度/OD600（≥50RFU/OD，参照ASTME2945）、分裂期ROS变化（G1期/S期比值≥1.5）
• 真菌菌丝ROS：顶端/基部荧光比值（≥3:1）、产孢期ROS峰值（≥100RFU）
• 益生菌ROS耐受：处理后存活率（≥70%）、ROS清除酶活性（CAT/POD升高倍数≥2倍）

ROS与细胞器关联分析：

• 线粒体功能关联：ROS生成速率与ATP产量比值（≤0.1pmol/μmolATP）、膜电位变化（ΔΨm下降率≤20%时ROS升高倍数）
• 内质网应激关联：ROS峰值与GRP78表达量相关性（r≥0.8）、钙稳态影响（[Ca^2+]i升高率≥50%时ROS变化）
• 细胞核损伤关联：ROS水平与DNA断裂指数（cometassay尾矩，r≥0.75）

ROS定量方法验证：

• 方法精密度：日内变异系数（CV，≤5%）、日间变异系数（≤8%）
• 方法准确度：回收率（90%-110%，参照GB/T39868）、比对试验（与电化学法偏差≤10%）
• 线性范围：1-1000nM（R²≥0.99）、定量限（LOQ，≤3nM）

检测范围

1.哺乳动物细胞系：涵盖HepG2、HeLa、MCF-7等肿瘤细胞及HUVEC、L929等正常细胞，重点检测药物或毒素诱导的细胞内ROS动态变化

2.植物组织：包括拟南芥叶片、水稻根、番茄果实等，侧重逆境胁迫（干旱、重金属、盐渍）下ROS的空间分布与代谢速率

3.微生物样本：涵盖大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌等，关注代谢活动或抗生素处理后的ROS生成及清除机制

4.药物候选化合物：包括小分子药物、天然产物提取物等，评估其诱导或抑制ROS生成的浓度依赖性及细胞毒性关联

5.抗氧化剂：涵盖维生素C、谷胱甘肽、植物多酚等，检测其对ROS的清除速率及长期保护作用

6.环境水体：包括河水、废水、饮用水等，量化水中污染物（如重金属、有机物）引发的ROS生成潜能

7.食品样品：涵盖油脂、水果汁、肉制品等，监测氧化变质过程中的ROS积累及抗氧化剂有效性

8.化妆品原料：包括防腐剂、美白成分、保湿剂等，评价其对皮肤细胞（如HaCaT）ROS水平的影响

9.纳米材料：涵盖TiO2、SiO2、量子点等，分析其进入生物体系（细胞/动物）后诱导的ROS产生及毒性机制

10.动物组织匀浆：包括肝脏、心肌、脑等，检测病理状态（如缺血再灌注、糖尿病）下的ROS生成速率及氧化损伤程度

检测方法

国际标准：

• ISO21331-2019荧光法测定生物样品中活性氧簇生成速率（强调荧光探针稳定性测试≥4小时，推荐使用DCFH-DA作为通用探针）
• ASTME2945-2021微生物体系中ROS代谢的荧光监测方法（采用固定时间点采样法，适用于慢反应体系）
• EN16479-2020环境样品中ROS生成潜能的测定（推荐实时动态监测模式，要求样本前处理采用0.22μm滤膜过滤）

国家标准：

• GB/T39868-2021细胞内活性氧簇检测荧光探针法（增加细胞毒性预实验CC50≥100μM的要求，推荐使用MitoSOXRed检测线粒体ROS）
• GB/T40185-2021抗氧化剂清除ROS能力的测定荧光法（规定了清除速率常数的计算方法，要求反应体系pH=7.4±0.1）
• GB/T27417-2017实验室质量控制荧光分析方法通则（强调仪器校准的溯源性，要求每批样品带空白对照）

（方法差异说明：ISO21331与GB/T39868的主要差异在于，ISO21331未强制要求细胞毒性预实验，而GB/T39868将其作为必做项目；ASTME2945与EN16479的差异在于，ASTME2945的采样间隔为15分钟，EN16479要求间隔≤5分钟以捕捉快速反应；GB/T40185与ISO21331的荧光探针选择不同，GB/T40185推荐使用DPPH作为对照探针，而ISO21331推荐使用H2DCFDA）

检测设备

1.激光共聚焦显微镜：ZeissLSM880（激光波长405nm/488nm/561nm，油镜NA=1.46，活细胞培养系统37℃/5%CO2）

2.多功能酶标仪：TecanSpark10M（荧光检测灵敏度≤1fmol，动力学扫描间隔≤1秒，波长范围200-900nm）

3.流式细胞仪：BDFACSAriaIII（荧光通道≥8个，检测速率≥10000细胞/秒，分选纯度≥99%）

4.荧光分光光度计：HitachiF-7000（信噪比≥1000:1，扫描速度1200nm/min，样品池光程10mm）

5.活细胞成像系统：PerkinElmerUltraVIEWVoX（帧率≥30fps，Z轴步进≤0.1μm，荧光滤光片组≥10组）

6.微流控芯片分析仪：FluidigmBioMarkHD（通道数48.48，检测限≤1nM，样本量≤5μL）

7.二氧化碳培养箱：ThermoScientificForma3111（温度波动±0.1℃，CO2浓度波动±0.1%，相对湿度≥95%）

8.超纯水仪：MilliporeSynergyUV（电阻率≥18.2MΩ·cm，总有机碳≤5ppb，细菌含量≤1CFU/mL）

9.电子天平：MettlerToledoXS205（可读性0.01mg，最大载荷220g，重复性≤0.02mg）

10.移液器：EppendorfResearchPlus（量程1-10μL，精度±0.03μL，误差≤1%）

11.恒温水浴锅：HuberMinistat230（温度范围-10至100℃，精度±0.01℃，浴槽容量5L）

12.超声波细胞破碎仪：SonicsVCX130（功率130W，频率20kHz，探头直径6mm，定时范围0-99分钟）

13.低温高速离心机：Eppendorf5810R（最大转速15000rpm，温度范围4-37℃，容量4×750mL）

14.荧光显微镜：OlympusFV3000（激光波长405nm/488nm/561nm，分辨率≤0.2μm，内置图像分析软件）

15.全自动样品处理系统：BeckmanCoulterBiomek4000（移液精度±0.5%，处理能力≥1000样本/小时，兼容96/384孔板）

北检(北京)检测技术研究院【简称：北检院】

报告：可出具第三方检测报告(电子版/纸质版)。

检测周期：7~15工作日，可加急。

资质：旗下实验室可出具CMA/CNAS资质报告。

标准测试：严格按国标/行标/企标/国际标准检测。

非标测试：支持定制化试验方案。

售后：报告终身可查，工程师1v1服务。

以上是与"活性氧簇生成速率荧光标记测定"相关的简单介绍，具体试验/检测周期、检测方法和仪器选择会根据具体的检测要求和标准而有所不同。北检研究院将根据客户需求合理的制定试验方案。