可送检的样品类型与对应检测项目
| 样品类型 | 典型应用场景 | 主要检测项目 | 常用方法 / 参考 |
|---|---|---|---|
| 启动子调控序列样品 | 基因表达调控研究、启动子核心区与转录起始位点定位 | 相对启动子活性、截短系列活性谱、位点突变活性变化 | 萤火虫荧光素酶报告载体构建加海肾酶内参归一化 |
| 转录因子调控体系 | 转录因子过表达、敲低与结构域功能研究 | 转录因子激活或抑制倍数、剂量效应曲线 | 报告质粒与转录因子表达质粒共转染双读数 |
| miRNA靶基因验证样品 | miRNA、lncRNA与靶基因3'UTR互作确认 | 野生型3'UTR抑制率、种子区突变回复率 | mimic与inhibitor共转染加双荧光检测 |
| 信号通路报告体系 | 通路激动剂与抑制剂筛选、药物药效评价 | 通路响应倍数、半数效应浓度 | 响应元件串联报告质粒加双荧光读数 |
| 药物处理细胞样品 | 小分子化合物、细胞因子对基因表达的影响研究 | 浓度效应关系、细胞活力联合评价 | 双荧光比值加细胞计数与活力联测 |
| 转染后细胞裂解物 | 异地完成转染仅需发光检测的委托样品 | 萤火虫酶读数、海肾酶读数、归一化比值 | 被动裂解上样加双底物顺序发光 |
检测项目
1. 相对荧光素酶活性：萤火虫酶与海肾酶双读数归一化比值，读数线性范围跨6个数量级，检测限达10⁻¹⁸mol酶量级
2. 启动子转录活性：以空载体为阴性对照，活性倍数报告范围0.1-1000倍，每组3复孔、独立重复3次，p值小于0.05判定显著
3. miRNA靶点抑制率：野生型3'UTR活性抑制≥30%判定有效结合，种子区突变回复≥50%确认特异性靶点
4. 信号通路响应倍数：NF-κB、Wnt、CRE等报告体系激动后激活倍数典型2-50倍，浓度效应拟合EC50跨度10⁻¹⁰-10⁻⁴mol/L
5. 内参一致性质控：海肾酶内参读数组内变异系数CV≤15%，复孔归一化比值CV≤20%为有效数据判定线
检测范围
1. 报告质粒体系：萤火虫荧光素酶报告载体、海肾荧光素酶内参载体（TK、SV40组成型启动子驱动）
2. 细胞模型：HEK293T、HeLa、HepG2、CHO、NIH/3T3等常用转染细胞系及原代培养细胞
3. 研究方向：启动子与增强子活性分析、转录因子调控、miRNA与lncRNA靶基因验证、信号通路活性监测
4. 受试物类型：小分子化合物、细胞因子、中药提取物、抗体与生物制品
5. 样品形式：质粒DNA冻干粉、甘油菌、转染后细胞裂解物、冻存细胞株全流程委托
检测方法
1. GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求
2. GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
3. GB/T 39730-2020 细胞计数通用要求 流式细胞测定法
4. GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南
5. GB/T 27025.1-2019 检测和校准实验室能力的通用要求
6. 双荧光素酶报告基因检测系统操作规程：荧光素与腔肠素双底物顺序发光检测，萤火虫酶淬灭效率大于99%，海肾酶同步激活
检测设备
1. 单模微孔板发光检测仪：灵敏度达10⁻¹⁸mol酶量级，积分时间0.1-10s可调，兼容96/384孔板
2. 多功能微孔板读数仪：发光、荧光、吸光度三模式检测，光栅1nm步进
3. 双荧光素酶顺序进样检测系统：自动顺序注入底物与淬灭试剂，淬灭效率大于99%
4. 二氧化碳培养箱：温度37±0.1℃，二氧化碳浓度5±0.1%，相对湿度大于90%
5. 生物安全柜：A2型，下降风速0.25-0.35m/s，高效过滤器对0.3μm微粒截留效率99.999%
6. 台式低温离心机：转速100-15000rpm，温控4℃，最大相对离心力20000g
7. 倒置荧光显微镜：配置DAPI、FITC、TRITC三色滤片组，物镜4-40倍，转染效率观察
8. 流式细胞仪：激光488nm与640nm双光源，荧光检测通道4色，细胞活率与转染率定量
9. 核酸转染系统：电压50-500V可调，脉冲时长5-50ms，适配难转染细胞系电穿孔
10. 超微量分光光度计：核酸浓度检测范围2-15000ng/μL，质粒纯度A260/A280判定1.8-2.0