可送检的样品类型与对应检测项目
| 样品类型 | 典型应用场景 | 主要检测项目 | 常用方法 / 参考 |
|---|---|---|---|
| EDTA抗凝外周血全血 | ATP7B基因全外显子突变谱分析、家系成员分型、杂合携带筛查研究 | 全部21个外显子及剪接侧翼序列变异、中国人群热点突变分型、外显子水平拷贝数变异 | Sanger双向测序、高通量测序靶向捕获、MLPA剂量分析；参照GB/T 30989-2014 |
| 基因组DNA（提取后核酸） | 测序文库构建前核酸质控、核酸入库保存前评估 | DNA浓度、A260/280与A260/230纯度比值、片段完整性、核酸总量 | GB/T 40974-2021《核酸样本质量评价方法》；荧光染料定量与超微量分光光度联用 |
| 口腔拭子/唾液来源核酸 | 无创采样场景下的核酸获取与适用性评估 | 核酸提取回收率、人源基因组DNA占比、扩增抑制物残留评估 | GB/T 37874-2019《核酸提取纯化方法评价通则》；磁珠法提取结合抑制物去除柱 |
| 细胞/组织来源基因组DNA | 细胞模型基因型确认、编辑细胞克隆筛选 | ATP7B目标区段测序、基因型一致性核对、突变丰度定量 | Sanger测序、数字PCR丰度定量；靶区覆盖度≥95%判定 |
| 突变型/野生型核酸标准品（梯度混合） | 方法学性能验证、检出限确认、室内质控与室间比对 | 梯度突变丰度（5%、1%、0.5%）检出限、重复性CV、线性相关系数 | 数字PCR定值、荧光定量PCR梯度扩增；参照GB/T 44586.1-2024通用要求 |
| 家系成员外周血核酸 | 父母杂合携带验证、家系共分离分析 | 候选变异位点家系Sanger验证、分离比核算 | Sanger双向测序单点验证；结合HGVS命名输出cDNA与蛋白水平编号 |
检测项目
1. ATP7B基因全外显子测序：覆盖全部21个外显子及剪接供受体位点侧翼约20bp，目标区域覆盖度≥95%，平均测序深度≥100×
2. 热点突变分型：p.Arg778Leu、p.Arg778Gly、p.Pro992Leu、p.Thr935Met等中国人群高频位点，突变丰度检出限低至1%~5%
3. 外显子拷贝数变异检测：MLPA法覆盖21个外显子的杂合/纯合缺失与重复判读，剂量比阈值0.65~1.30之外判定异常
4. 核酸质控：基因组DNA浓度≥20ng/μL，总量≥1μg，A260/280比值1.7~2.0，主带完整无明显降解
5. 测序数据质量：Q30碱基比例≥85%，单碱基质量值≥Q20，链间平衡偏差控制在10%以内
6. 变异分类与命名：按ACMG/AMP五级分类（致病、可能致病、意义未明、可能良性、良性），输出HGVS规范的cDNA与蛋白水平命名
检测范围
1. 全外显子测序样本：ATP7B基因21个外显子及剪接位点区域的点突变与小片段插入缺失
2. 热点突变筛查样本：外显子12~14等中国人群高频突变富集区段的定向分型
3. 大片段变异样本：外显子水平缺失/重复等拷贝数变异的剂量判读
4. 核酸类样本：EDTA抗凝全血、口腔拭子、唾液及细胞培养物来源的基因组DNA
5. 质控与标准品：突变型/野生型基因组DNA梯度混合物、合成核酸片段标准品
6. 家系样本：疑似家系成员的候选变异位点共分离验证与分离比分析
检测方法
1. GB/T 30989-2014 高通量基因测序技术规程（靶向捕获测序流程总纲）
2. GB/T 35537-2017 高通量基因测序结果评价要求（数据质量与结果判定）
3. GB/T 40974-2021 核酸样本质量评价方法（核酸浓度、纯度与完整性评估）
4. GB/T 44586.1-2024 体外诊断医疗器械 多重核酸分子检测 第1部分：核酸质量评价术语和通用要求
5. YY/T 1865-2022 BRCA基因突变检测试剂盒及数据库通用技术要求（高通量测序法）（遗传病基因NGS检测方法学参照）
6. YY/T 1800-2021 耳聋基因突变检测试剂盒（单基因遗传病突变检测试剂方法参照）
7. GB/T 29889-2013 人体疾病易感DNA多态性检测基因芯片（芯片法基因分型参照）
8. GB/T 37874-2019 核酸提取纯化方法评价通则（提取回收率与纯化质量评价）
检测设备
1. 高通量测序仪(Illumina NovaSeq 6000)：读长2×150bp，单次运行通量最高6Tb，Q30碱基比例≥85%
2. 高通量测序仪(MGI MGISEQ-2000)：DNBSEQ技术，读长2×150bp，单次运行通量最高75Gb
3. Sanger测序仪(ABI 3500xL)：24毛细管阵列，单碱基读长800~1000bp，双向测序确认变异
4. 实时荧光定量PCR仪(QuantStudio 5)：96孔，温度均匀性±0.25℃，升降温速率最高6℃/s
5. 梯度PCR扩增仪(Veriti 96孔)：温控精度±0.5℃，容量96×0.2mL，支持梯度退火优化
6. 磁珠法核酸提取工作站：96样本通量，单孔处理体积50~1000μL，配套封板与振荡模块
7. 超微量分光光度计(NanoDrop One)：核酸检测浓度2~15000ng/μL，波长范围190~850nm，仅需1~2μL样本
8. 荧光计(Qubit 4)：dsDNA HS荧光模式，检测下限达0.5ng/mL级，用于文库精确定量
9. 片段分析仪(Agilent 4200 TapeStation)：检测范围25~60000bp，96样本通量，评估文库片段分布
10. MLPA配套毛细管电泳仪(ABI 3500 Dx)：片段分析分辨率1bp（100~500bp区段），外显子剂量比自动判读