可送检的样品类型与对应检测项目

样品类型 典型应用场景 主要检测项目 常用方法 / 参考
果树韧皮部组织 枣疯病、梨衰退病等果园病害诊断，母树与采穗圃健康认证 16S rRNA巢式PCR筛查、16Sr组别鉴定、滴度绝对定量、DAPI荧光初筛 GB/T 36843-2018、GB/T 40141-2021检疫鉴定框架；巢式PCR通用引物P1/P7与R16F2n/R16R2
林木苗木与成株 泡桐、榆树、桑树苗木调运检疫，丛枝病除治效果评估 植原体存在性筛查、组别鉴定、株系系统发育分型 巢式PCR结合RFLP酶切图谱比对，相似系数不低于0.97归组
花卉与观赏植物 翠菊、长春花黄化与花变叶症状确诊，组培脱毒苗质量验证 16S rRNA基因筛查、滴度绝对定量、脱毒效果评价 TaqMan实时荧光定量PCR，标准曲线R²不低于0.99
繁殖材料 接穗、插穗、砧木引进与隔离试种核查，无毒繁育体系认证 植原体携带筛查、组别鉴定、批量样品阳性率统计 韧皮部总DNA提取后巢式PCR扩增与序列测定确证
介体昆虫 叶蝉、木虱、飞虱种群带毒率监测与病害流行预警 单虫带毒筛查、种群带毒率统计 单头昆虫研磨提取DNA后扩增16S rRNA基因
经济作物与药用植物 花生丛枝、水稻橙叶、金银花丛枝等病害诊断与损失评估 症状复核、植原体筛查与株系分型 DAPI染色初筛结合巢式PCR确证，必要时透射电镜观察

检测项目

1. 16S rRNA基因巢式PCR筛查：目标片段约1.2kb，植原体DNA检出限可至pg级，适用于低滴度隐性带毒样品

2. 16Sr组别与亚组鉴定：AluI、MseI、HhaI等内切酶RFLP图谱比对，相似系数不低于0.97归组，覆盖16SrI至16SrXXXII主要组群

3. 植原体滴度绝对定量：TaqMan探针实时荧光定量PCR，动态范围10²-10⁸拷贝/μL，扩增效率90%-110%

4. 韧皮部菌体显微观察：DAPI荧光初筛与透射电镜确证，菌体呈球形、椭圆形或丝状，直径80-1000nm

5. 株系系统发育分型：tuf、secY、rp等多基因序列测定，相似率不低于97.5%判定候选种，自展值不低于70%

检测范围

1. 果树病害：枣疯病、梨衰退病、苹果增枝病、樱桃X病、葡萄黄叶坏死

2. 林木病害：泡桐丛枝病、榆韧皮部坏死、桑萎缩病

3. 花卉病害：翠菊黄化病、长春花黄化、仙客来花变叶

4. 经济作物病害：花生丛枝病、水稻橙叶病、甘薯丛枝病、椰子致死性黄化

5. 繁殖材料与介体：接穗、插穗、组培脱毒苗以及叶蝉、木虱、飞虱等传毒介体

检测方法

1. GB/T 36843-2018 梨衰退植原体检疫鉴定方法，采用16S rRNA基因巢式PCR结合RFLP与序列分析完成鉴定

2. GB/T 40141-2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法，巢式PCR扩增与限制性片段长度多态性图谱判定

3. GB/T 3543.7-1995 农作物种子检验规程 其他项目检验，为健康测定提供扦样与检验框架

4. DAPI荧光染色法：叶脉或叶柄切片经4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色后，荧光显微镜330-380nm激发观察韧皮部荧光

5. 透射电镜观察法：戊二醛与四氧化锇双固定、环氧树脂包埋，70-90nm超薄切片下观察筛管内多形态菌体

6. 实时荧光定量PCR法：TaqMan探针靶向16S rRNA或延伸因子基因，标准品制备绝对定量曲线

检测设备

1. 梯度PCR扩增仪（T1000型）：温控范围4-99℃，升温速率6℃/s，梯度温差最大30℃

2. 实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 5型）：支持FAM、HEX、ROX、CY5检测通道，动态范围10个数量级

3. 荧光显微镜（BX53型）：DAPI激发330-380nm，发射420nm以上，配落射荧光照明系统

4. 透射电子显微镜（HT7800型）：加速电压40-120kV，点分辨率0.2nm级

5. 超薄切片机（EM UC7型）：切片厚度调节50-100nm，进给精度1nm

6. 凝胶成像分析系统（Gel Doc XR+型）：300万像素CMOS检测，配302nm紫外与蓝光双光源

7. 高速冷冻离心机（5430R型）：最高转速15000rpm，最大相对离心力21000g，温控-10-40℃

8. 超微量分光光度计（NanoDrop One型）：dsDNA检测范围2-15000ng/μL，取样量1μL

9. 组织研磨仪（MM400型）：振荡频率3-30Hz，适配2mL离心管批量低温研磨