黄瓜黄化病毒检测

检测项目

1.病毒核酸序列分析：采用RT-PCR扩增CP基因（引物CYV-F:5'-ATGGCGATCAACAAAG-3'；CYV-R:5'-TTAGTCGCCGTCTTCG-3'），扩增条件为94℃预变性5min，35个循环（94℃30s/55℃30s/72℃1min）

2.病毒粒子形态观察：透射电镜观测杆状病毒粒子（650-800nm12-15nm），负染剂为2%磷钨酸（pH6.8）

3.血清学检测：DAS-ELISA法测定OD405值≥0.3判为阳性，使用Cucumovirus属多克隆抗体（效价≥1:10000）

4.寄主植物接种试验：汁液摩擦接种本氏烟（Nicotianabenthamiana），观察7-14天内系统性黄斑症状

5.实时荧光定量PCR：TaqMan探针法（FAM标记），定量限达10copies/μl，退火温度580.5℃

检测范围

1.黄瓜种子：重点检测种皮携带的潜伏病毒RNA

2.植株叶片：采集新梢顶端第3-4片展开叶进行ELISA筛查

3.果实样本：果肉组织研磨液离心上清（10000rpm,10min）用于电镜观测

4.土壤基质：采用PEG沉淀法富集土壤浸出液中的病毒颗粒

5.灌溉用水：0.22μm滤膜浓缩后提取总核酸进行qPCR定量

检测方法

1.ISO16140-6:2019《分子生物学方法验证规程》用于RT-PCR特异性验证

2.GB/T28068-2011《植物病毒酶联免疫吸附测定法》规范ELISA操作流程

3.ASTME2396-19《植物病害诊断电镜技术指南》规定负染色操作参数

4.GB/T3543.5-1995《农作物种子检验规程》第Ⅴ部分病毒检测要求

5.ISO21571:2005《分子生物学核酸检测样品制备标准》指导RNA提取流程

检测设备

1.实时荧光定量PCR仪（ABI7500）：TaqMan探针法绝对定量病毒载量

2.透射电子显微镜（JEOLJEM-1400）：120kV加速电压下观测病毒超微结构

3.全自动酶标仪（BioTekEpoch2）：双波长读取ELISA板吸光度值

4.超速离心机（BeckmanOptimaXPN-100）：最大转速100,000rpm富集病毒颗粒

5.核酸提取工作站（KingFisherFlex）：磁珠法批量处理植物组织样本

6.PCR扩增仪（EppendorfMastercyclernexuJianCeX）：梯度PCR程序优化体系

7.冷冻切片机（LeicaCM1950）：制备50μm厚植物组织切片用于原位杂交

8.生物安全柜（ESCOAirstreamACB-4E）：提供ISOClass3级病原操作环境

9.超低温冰箱（ThermoScientificTSX700）：-80℃长期保存阳性对照毒源

10.凝胶成像系统（Bio-RadChemiDocMP）：SYBRGreenI染色电泳条带分析