检测项目

1.菌核形态学鉴定：测量菌核直径（3-7mm）、颜色（黑色至深褐色）及表面纹理（粗糙或光滑）

2.病原菌分离培养：采用PDA培养基（pH6.50.2），25℃暗培养5-7天观察菌丝特征

3.分子生物学检测：ITS序列分析（引物ITS1/ITS4），PCR扩增条件：94℃预变性5min→35循环（94℃30s/55℃30s/72℃1min）

4.致病性测定：离体叶片接种试验（接种量10^5孢子/mL），湿度>90%条件下观察病斑扩展速率

5.抗药性监测：测定菌株对腐霉利（Procymidone）的EC50值（0.1-5μg/mL梯度浓度）

检测范围

1.大丽菊植株叶片病斑样本（直径≥5mm典型轮纹状病斑）

2.茎基部腐烂组织样本（含水率≤60%的坏死组织）

3.栽培基质残留菌核（土壤深度0-15cm处采集）

4.种子带菌筛查（千粒种子表面灭菌后PDA培养法）

5.灌溉水样病原检测（滤膜孔径0.45μm富集法）

检测方法

ISO16140-3:2021《食品链微生物学-方法验证-第3部分》用于分子检测流程验证

GB/T28068-2011《花卉植物真菌病害检测规程》规范菌核形态鉴定程序

ASTME1873-22《植物病原真菌抗药性测定标准指南》指导抗药性试验设计

NY/T401-2000《花卉种苗产地检疫规程》规定田间采样密度（每公顷≥20点）

SN/T4283.2-2015《出口植物检疫实验室质量规范》控制PCR检测假阴性率≤5%

检测设备

1.PCR扩增仪（Bio-RadT100ThermalCycler）：程序化温度控制精度0.2℃

2.超净工作台（ESCOAC2-4S1）：HEPA过滤器达到ISO14644-1Class5标准

3.体视显微镜（OlympusSZX7）：10-70连续变倍观察菌核微观结构

4.冷冻离心机（Eppendorf5424R）：最大转速15,000rpm用于DNA提取

5.全自动酶标仪（ThermoMultiskanSkyHigh）：波长范围340-850nm测定OD值

6.恒温培养箱（MemmertICP800）：温度均匀性0.5℃@37℃

7.核酸电泳系统（Bio-RadPowerPacBasic）：电压范围10-300V进行DNA片段分离

8.超低温冰箱（HaierDW-86L626）：-86℃长期保存菌种及核酸样本

9.生物安全柜（NuAireNU-437-400）：二级生物安全防护处理活体病原

10.激光共聚焦显微镜（LeicaTCSSP8）：405nm/488nm/638nm三激光通道观察菌丝侵染过程