可送检的样品类型与对应检测项目
| 样品类型 | 典型应用场景 | 主要检测项目 | 常用方法 / 参考 |
|---|---|---|---|
| 工程菌发酵菌体 / 菌液 | 大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3) 等重组菌的发酵培养与诱导表达工艺监控 | 质粒拷贝数、每细胞拷贝数、质粒 DNA 得率、质粒保持率、菌体质粒浓度 | qPCR 绝对定量、微滴式数字 PCR、紫外分光光度法 |
| 质粒 DNA 原液 | 载体构建中间体、参考物质研制、分子生物学实验原料 | 拷贝数浓度（copies/μL）、总浓度（ng/μL）、纯度 A260/A280、A260/A230、超螺旋比例 | 荧光染料法、毛细管电泳、实时荧光定量 PCR |
| 重组菌种库（种子批） | 原始菌种库、主菌种库、工作菌种库的稳定性考察 | 传代拷贝数稳定性、质粒丢失率、抗性标记保持率 | 传代培养结合 qPCR 世代追踪、平板抗性筛选复核 |
| 稳转细胞系与工程细胞 | 慢病毒转导细胞库建立、稳转池克隆筛选验证 | 整合拷贝数、载体拷贝数批间一致性 | 微滴式数字 PCR、qPCR 相对定量 |
| 体外转录模板与拷贝数标准品 | 线性化质粒模板定量、拷贝数标准品定值 | 模板拷贝数浓度、定值偏差、批间一致性、线性响应 | dPCR 绝对定值、梯度稀释标准曲线验证 |
| 环境与粪便核酸提取物 | 耐药基因丰度调查、质粒介导的水平传播研究 | 抗性基因拷贝数、质粒靶标丰度、16S rRNA 基因归一化定量 | qPCR、数字 PCR |
| 农杆菌与植物转化材料 | 双元载体转化效率评估、转化体事件鉴定 | 载体拷贝数、边界序列完整性、靶基因整合拷贝数 | qPCR 相对定量、dPCR 绝对定量 |
检测项目
1. 质粒绝对拷贝数：定量范围 10¹~10⁹ copies/反应，标准曲线线性相关系数 R²≥0.99
2. 每细胞拷贝数：pUC 类高拷贝复制子 500~700 copies/细胞，ColE1 衍生中拷贝 15~25 copies/细胞，pSC101/BAC 类低拷贝 1~5 copies/细胞
3. 质粒 DNA 浓度与纯度：总浓度 0.2~15000 ng/μL，A260/A280 控制在 1.80~2.00，超螺旋比例≥80%
4. qPCR 扩增效率：90%~110%，对应标准曲线斜率 -3.1~-3.6，熔解曲线单峰无引物二聚体
5. 质粒稳定性：传代 50 代后质粒保持率≥95%，拷贝数批间相对标准偏差 RSD≤15%
检测范围
1. 高拷贝质粒：pUC19、pUC57、pGEM-T 等 pUC 复制子载体
2. 中拷贝质粒：pBR322、pET-28a(+)、pTrc99A 等 ColE1 衍生载体
3. 低拷贝质粒：pSC101、pBeloBAC11、pCC1FOS 等严谨型单拷贝载体
4. 酵母与穿梭载体：pPIC9K、pYES2、pRS 系列酵母整合 / 游离载体
5. 包装与模板质粒：慢病毒四质粒系统、pAAV 载体、体外转录线性化模板
检测方法
1. ISO 20395:2019 生物技术 核酸靶序列定量方法性能评价要求 qPCR 与 dPCR 法
2. MIQE 指南（2009） 实时荧光定量 PCR 实验最低信息量要求，规范引物效率、标准曲线与复孔报告
3. dMIQE 指南（2020） 数字 PCR 实验最低信息量要求，规范微滴生成、泊松统计与不确定度报告
4. 绝对定量标准曲线法：以 10 倍梯度稀释的已知拷贝数质粒标准品构建 Ct-Log(copies) 线性回归方程
5. 微滴式数字 PCR 绝对定量法：样品分割至上万个微滴，统计阳性微滴比例按泊松分布直接换算拷贝数浓度
检测设备
1. 实时荧光定量 PCR 仪（96 孔）：支持 SYBR Green 与探针双模式，动态范围 10¹~10¹⁰ copies/反应，孔间温度均一性±0.25℃
2. 微滴式数字 PCR 系统：每样品微滴数≥20000 个，单分子级检测灵敏度，无需依赖标准曲线
3. 超微量分光光度计：取样量 1~2 μL，双链 DNA 检测范围 2~15000 ng/μL
4. 荧光定量仪（双链 DNA 高灵敏度试剂）：检测下限低至 0.005 ng/μL，专一性优于紫外吸收法
5. 毛细管电泳片段分析系统：DNA 片段分离范围 25~12000 bp，分辨率 1 bp，进样量 1~2 μL
6. 凝胶成像与灰度分析系统：制冷 CCD 相机，紫外与蓝光双光源，支持琼脂糖凝胶半定量与超螺旋比例估算
7. 高速冷冻离心机：最大相对离心力 30000×g，温控范围 -10~40℃
8. 恒温金属浴 / 混匀仪：控温范围 4~105℃，控温精度±0.5℃，用于碱裂解与酶反应孵育
9. 振荡培养箱：转速 50~400 rpm，温度控制 25~60℃，用于菌体培养与传代
10. 二级生物安全柜：70% 循环 / 30% 排风气流模式，下降风速 0.35~0.55 m/s，保障核酸操作防污染