检测项目

1.NNV核酸定性检测：靶向病毒RNA聚合酶基因（RdRp）及衣壳蛋白基因（CP），灵敏度≥10^2copies/μL

2.病毒抗原蛋白分析：采用单克隆抗体检测CP蛋白浓度阈值≥0.1ng/mL

3.抗体效价测定：血清中和试验抗体滴度≥1:32判为阳性

4.病毒分离培养：SPF胚胎细胞系（SSN-1）病变效应观察周期7-14天

5.病理组织学检查：脑组织空泡化程度分级（Ⅰ-Ⅳ级）判定标准

检测范围

1.海水鱼苗：石斑鱼、鲈鱼、军曹鱼等仔稚鱼全鱼样本

2.成鱼组织：脑组织、视网膜、脊髓等器官冻存样本

3.养殖水体：0.22μm滤膜富集病毒颗粒

4.鱼卵表面附着物：含10%胎牛血清的PBS洗脱液处理样本

5.冷冻鱼产品：肌肉组织RNA完整性OD260/280≥1.8

检测方法

ISO11733:2021《水生动物病毒核酸检测规范》实时荧光RT-PCR法

GB/T34755-2017《鱼类病毒性神经坏死病诊断规程》病理学诊断标准

OIEManualChapter2.3.7NNV分离培养技术要求

ASTME2888-19《水生动物血清中和试验操作指南》

SN/T1674-2019《出口活鱼检疫规程》现场快速检测方法

检测设备

AppliedBiosystems7500实时荧光定量PCR仪：支持TaqMan探针法核酸检测

ThermoFisherSorvallST8离心机：最大转速20,000rpm用于病毒富集

LeicaCM1950冷冻切片机：制备5μm厚度病理组织样本

Eppendorf5424R微量离心机：适配1.5mL病毒RNA提取管

NanoDropOne超微量分光光度计：检测RNA纯度及浓度

BioTekSynergyH1酶标仪：完成ELISA抗原抗体检测

SanyoMCO-20AICCO2培养箱：维持SSN-1细胞培养环境

OlympusBX53荧光显微镜：观察细胞病变效应(CPE)

CryotomeFSE冰冻切片机：制作未固定新鲜组织切片

MiltenyiBiotecGentleMACS组织匀浆仪：处理高粘度脑组织样本